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传染性法氏囊病病毒VP2基因的表达与单克隆抗体的制备

作　者: 曹冰玉
导　师: 王永山；范红结
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 传染性法氏囊病病毒 重组VP2蛋白 大肠杆菌表达 杆状病毒表达 单克隆抗体
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的以侵害雏鸡淋巴组织,特别是中枢免疫器官一法氏囊为主要特征的传染病。该病不仅引起患病动物死亡,还会导致机体免疫抑制,使机体的免疫防御能力降低和疫苗免疫接种失败,每年给养禽业带来巨大经济损失。近年来,由于各地出现的IBDV变异株、强毒株的毒力和抗原性存在一定差异,可逃避现行疫苗的免疫,IBD的流行呈现更为复杂的态势,给该病的防控造成较大困难。IBDV VP2蛋白是病毒主要的结构蛋白和宿主保护性抗原,因此针对VP2蛋白及IBDV检测方法的研究是当前重要的研究内容。本文将流行毒株IBDV VP2基因分别在大肠杆菌和杆状病毒表达系统中进行表达,获得了针对VP2蛋白的单克隆抗体。试验内容主要包括以下三个部分：1.传染性法氏囊病病毒VP2基因在大肠杆菌中的表达将从安徽省传染性法氏囊病(IBD)免疫失败的病鸡法氏囊组织中扩增的VP2基因定向克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建了原核表达质粒pGEX-VP2,并转化大肠杆菌Rosetta (DE3).经IPTG诱导后,用IBDV双抗体夹心ELISA检测,结果呈阳性反应：SDS-PAGE分析结果显示,重组VP2融合蛋白的分子质量为68 ku,表达量约占菌体总蛋白量的16.0%,表达产物主要以包涵体形式存在于菌体内；Western-blotting结果显示,重组VP2蛋白与IBDV抗体发生反应,形成一条特异性蛋白带,表明获得的重组蛋白具有良好的抗原反应性。2.传染性法氏囊病病毒VP2基因在昆虫细胞中的表达为制备针对传染性法氏囊病病毒(IBDV)流行毒株的重组VP2蛋白,将从安徽省IBD免疫失败的病鸡法氏囊组织中扩增的VP2基因插入到杆状病毒表达系统供体质粒pFastBacHTA中,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,并成功获得重组杆状病毒表达质粒rBacHT-VP2,用脂质体法转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒vBacHT-VP2.经Western-blotting分析,在蛋白分子量约53 ku处出现特异性蛋白条带；以间接免疫荧光试验(IFA)检测vBacHT-VP2感染的Sf9细胞,具有特异性免疫荧光；电镜观察,重组VP2蛋白能够自组装成病毒样颗粒(VLPs)。3.传染性法氏囊病病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备与应用用大肠杆菌表达的传染性法氏囊病病毒(IBDV)重组VP2蛋白、杆状病毒表达的重组VP2蛋白以及纯化的IBDV分别免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术建立了9株分泌抗IBDV VP2蛋白的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies, mAbs)杂交瘤细胞系。间接ELISA检测9株mAbs的细胞培养上清液效价为4×10-2～1.6×10-3,腹水效价为10-2～10-5。Western-blotting结果表明,其中4株mAbs在蛋白分子量约53ku处有特异性条带,5株则未显示蛋白带。相加ELISA结果显示,单克隆抗体A12G、B12F、F9C对应相同的抗原表位,其余6株针对不同抗原表位。在夹心ELISA中,9株mAbs与新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、减蛋综合征病毒、禽流感病毒H9N2亚型、Sf9细胞培养上清液和CEF裂解物均无交叉反应。将9株杂交瘤细胞系进行传代培养、液氮冻存与复苏实验,杂交瘤细胞仍保持稳定分泌单克隆抗体的能力。用本实验制备的mAbs建立的IBDV夹心ELISA检测方法具有良好的特异性。

全文目录


摘要  8-10ABSTRACT  10-12缩略语表  12-13第一篇 文献综述  13-31  第一章 鸡传染性法氏囊病研究进展  13-26    1 IBDV概述  13-14    2 IBDV的基因组结构和编码的蛋白  14-16      2.1 IBDV的基因组  14      2.2 IBDV编码的蛋白  14-16        2.2.1 VP1蛋白  14-15        2.2.2 VP2蛋白  15        2.2.3 VP3蛋白  15-16        2.2.4 VP4蛋白  16        2.2.5 VP5蛋白  16    3 IBDV的防控  16-21      3.1 IBDV的检测方法  16-18        3.1.1 免疫学技术  17        3.1.2 分子生物学技术  17-18      3.2 基因工程疫苗的研究进展  18-21        3.2.1 重组亚单位疫苗  18-19        3.2.2 重组活载体疫苗  19        3.2.3 DNA疫苗  19-20        3.2.4 多表位疫苗  20-21    4 单克隆抗体技术  21-26      4.1 单克隆抗体技术的原理及制备方法  21-22      4.2 单克隆抗体技术的发展  22-24        4.2.1 杂交瘤技术的拓展  22        4.2.2 基因工程抗体  22-24      4.3 IBDV单克隆抗体的应用  24-26        4.3.1 IBDV的检测  24        4.3.2 IBDV抗原表位分析  24        4.3.3 IBDV的防治  24-26  参考文献  26-31第二篇 试验研究  31-67  第一章 传染性法氏囊病病毒VP2基因在大肠杆菌中的表达  31-41    1 材料与方法  32-34      1.1 质粒和菌株  32      1.2 主要试剂  32      1.3 VP2基因原核表达质粒的构建  32-33      1.4 VP2基因重组表达质粒的诱导表达  33      1.5 表达条件的优化  33      1.6 表达产物的鉴定  33-34        1.6.1 夹心ELISA检测  33        1.6.2 SDS-PAGE分析  33        1.6.3 Western-blotting分析  33-34    2 结果  34-36      2.1 VP2基因原核表达质粒的构建  34      2.2 VP2基因原核表达质粒的诱导表达  34-35      2.3 表达条件的优化  35-36      2.4 表达产物的鉴定  36        2.4.1 夹心ELISA检测  36        2.4.2 SDS-PAGE分析  36        2.4.3 Western-blotting分析  36    3 讨论  36-38    参考文献  38-41  第二章 传染性法氏囊病病毒VP2基因在昆虫细胞中的表达  41-51    1 材料与方法  42-44      1.1 质粒、菌株和细胞  42      1.2 主要试剂  42      1.3 重组杆状病毒供体质粒的构建  42-43      1.4 重组杆状病毒表达质粒的构建  43      1.5 重组杆状病毒的获得  43      1.6 重组杆状病毒的鉴定  43-44        1.6.1 Western blotting分析  43-44        1.6.2 IFA检测  44        1.6.3 电镜检查  44    2 结果  44-47      2.1 重组杆状病毒供体质粒的构建  44-45      2.2 重组杆状病毒表达质粒的构建  45-46      2.3 重组杆状病毒的获得  46      2.4 重组杆状病毒的鉴定  46-47        2.4.1 Western-blotting分析  46        2.4.2 IFA  46-47        2.4.3 电镜观察  47    3 讨论  47-49    参考文献  49-51  第三章 传染性法氏囊病病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备与应用  51-67    1 材料与方法  52-57      1.1 主要试剂  52      1.2 菌株、质粒和毒株  52-53      1.3 细胞系和实验动物  53      1.4 免疫抗原的制备  53-54        1.4.1 大肠杆菌表达的重组VP2蛋白的制备  53        1.4.2 杆状病毒表达的重组VP2蛋白的制备  53        1.4.3 IBDV病毒抗原的制备  53-54      1.5 杂交瘤细胞系的建立  54-55        1.5.1 动物免疫  54        1.5.2 细胞融合  54        1.5.3 杂交瘤细胞的筛选  54        1.5.4 杂交瘤细胞的克隆化  54-55        1.5.5 诱生腹水  55        1.5.6 杂交瘤细胞的稳定性  55      1.6 单克隆抗体的鉴定  55-56        1.6.1 类鉴定  55        1.6.2 抗体效价测定  55        1.6.3 抗原表位的分析  55        1.6.4 特异性鉴定  55-56      1.7 单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立  56-57        1.7.1 单克隆抗体的纯化  56        1.7.2 单克隆抗体的酶结合物的制备  56        1.7.3 夹心ELISA试验条件的优化  56-57        1.7.4 夹ELISA检测方法的应用  57    2 结果  57-61      2.1 免疫抗原的制备  57      2.2 杂交瘤细胞系的建立  57-58        2.2.1 筛选条件的确定  57        2.2.2 细胞融合结果  57-58        2.2.3 分泌抗体稳定性的测定  58      2.3 单克隆抗体的鉴定  58-60        2.3.1 亚类与抗体效价  58        2.3.2 抗原表位分析  58-59        2.3.3 抗体特异性  59-60      2.4 单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立  60-61        2.4.1 单克隆抗体的纯化和酶结合物的制备  60        2.4.2 夹心ELISA试验条件的优化  60-61        2.4.3 夹心ELISA检测方法的应用  61    3 讨论  61-63    参考文献  63-67全文总结  67-69附录:常用试剂的配制  69-73致谢  73-75攻读学位期间发表的学术论文目录  75

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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