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文昌鱼组织蛋白酶D基因的克隆、鉴定及功能研究

作　者: 陈荣
导　师: 汲广东
学　校: 中国海洋大学
专　业: 发育生物学
关键词: 文昌鱼 cathepsin D 克隆表达组蛋白H2A
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

组织蛋白酶D (cathepsin D,缩写CTSD, EC 3.4.23.5)是天冬氨酸蛋白酶家族的重要成员,属于酸性溶酶体内切酶,广泛存在于脊椎动物、真菌、反转录病毒和一些植物病毒中。CTSD主要是在溶酶体和内吞小体中对机体代谢产生的各种蛋白质以及抗原进行分解,在脊椎动物免疫过程中起重要作用。文昌鱼(amphioxus)是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡类型,是现存的与脊椎动物祖先最接近的无脊椎动物,一直被认为是研究脊椎动物起源和进化的重要模式动物。免疫系统的起源和进化是最近研究的热点之一。那么在文昌鱼中,CTSD的功能是什么?是否有类似脊椎动物的蛋白裂解功能,能否参与无脊椎动物的先天性免疫反应?为了回答上述问题,从青岛文昌鱼(Branchiostoma japonicus)中克隆具有完整开放阅读框的组织蛋白酶D基因,并对该基因的结构、进化、表达和功能进行研究。结果表明,青岛文昌鱼中存在一个全长为1772bp的CTSD cDNA,编码一个395个氨基酸的蛋白质,预测分子量为42.92 kDa。序列分析显示该蛋白与人的组织蛋白酶D同源性达到57.3%,具有典型的天冬氨酸蛋白酶家族结构,在其N-末端存在45氨基酸序列的前肽(1-45位残基),其中1-16位残基为信号肽,具有一个完整的Asp结构域,有两个Asp (Asp-Thr -Gly)活性中心,上述分析表明所得到的基因就是文昌鱼的组织蛋白酶D (AmphiCTSD)。用AmphiCTSD和其它物种CTSD的氨基酸序列构建系统进化树,发现AmphiCTSD与无脊椎动物的组织蛋白酶D聚为一支,提示文昌鱼AmphiCTSD基因较原始。其次,我们对AmphiCTSD基因在青岛文昌鱼中的表达情况做了研究。成体的实时定量和切片原位杂交实验表明,AmphiCTSD在文昌鱼的卵、后肠、肝盲囊和皮肤黏膜系统中表达量较丰富,而在精巢中微弱表达。胚胎原位杂交结果表明文昌鱼AmphiCTSD在其各个发育时期均有表达,尤其在细胞分裂旺盛部位表达较高,很可能与细胞分裂有关。神经胚至两天幼虫之间,AmphiCTSD在肠道部位表达丰度较高。用细菌外毒素(LPS, LTA)处理文昌鱼显示,AmphiCTSD的表达量分别在经上述外毒素诱导后12h和24h其表达水平至最低,而后逐渐上升。上述结果表明,AmphiCTSD很可能与免疫反应相关。为了在蛋白水平上验证文昌鱼的AmphiCTSD是否与免疫相关,我们构建AmphiCTSD原核表达载体,转化大肠杆菌后诱导表达。对纯化后的重组蛋白AmphiCTSD进行复性,复性后的AmphiCTSD在22℃、酸性条件下(pH3.5)可以自我催化去除掉酶原前体而成为37.8KDa有活性的形式。AmphiCTSD的活性可被组织蛋白酶D特异抑制剂胃酶抑素A抑制,但是不被PMSF, EDTA,亮肽素和抑肽酶等抑制剂抑制。对底物血红蛋白的酶切活性较低,可以将组蛋白H2A、大肠杆菌和葡萄球菌细胞壁降解,并且AmphiCTSD可以溶解大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,暗示AmphiCTSD的酶切活性可能参与了宿主的免疫反应。

文昌鱼组织蛋白酶D基因的克隆、鉴定及功能研究

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