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烟草中NAC类转录因子基因的克隆与分析

作　者: 王菲菲
导　师: 刘卫群
学　校: 河南农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 烟草 NAC类转录因子 基因克隆 表达
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


烟碱是烟草根系合成的次生代谢产物,是烟草特有的生物碱。打顶以后,烟株体内烟碱含量大量积累,然而对造成烟株体内烟碱含量升高的原因以及烟碱合成的调节机制并不清楚。打顶前后烟碱合成能力的巨大差异,是用来研究调控烟碱合成分子机制的最佳时期,通过筛选烟株打顶前、后根尖组织的差异表达的基因将有新的发现。植物中含有大量的转录因子基因,在调控植物生长发育和逆境胁迫应答中起重要作用。常见的转录因子家族有AP2/EREBP、bZIP、MYB、WRKY和NAC等。本研究以本实验室构建的SSH-cDNA文库中筛选出的NAC类转录因子EST序列为探针,电子克隆得到NtNAC-R1全长cDNA序列,对于研究调控烟碱生物合成的分子机制有重要意义。本实验主要结果如下:(1)荧光定量PCR验证SSH-cDNA文库差异基因EST序列打顶前后的表达模式,F-box、MYB、NAC、SAHH、ST1在打顶24h后表达水平上升,WRKY、AUXIN -induced mRNA在打顶24h后表达水平下降。(2)采用电子克隆和RT-PCR从烟草根尖组织克隆到NtNAC-R1。烟草NtNAC-R1开放性阅读框架长度为936 bp,编码311个氨基酸,具有NAC转录因子家族典型的保守结构域。(3)组织特异性分析表明NtNAC-R1基因在根系中具有高水平表达。RT-PCR和Northern杂交对烟草打顶前、后根尖组织中NtNAC-R1的表达模式分析表明该基因在烟株打顶后2—4 h表达水平下降,随后上升。(4)构建了重组表达载体pRSETB-NtNAC-R1,转化表达菌株大肠杆菌BL21系列菌株,成功表达目的蛋白,且目的蛋白以包涵体形式存在。(5)构建了NtNAC-R1基因的过量表达和反义抑制植物遗传转化载体,得到了该基因的反义抑制转基因植株。RT-PCR分析反义抑制转基因植株中烟碱合成相关基因PMT、ODC的表达模式表明这两个基因表达量下降。

全文目录


致谢  4-7摘要  7-81. 文献综述  8-11  1.1 转录因子概况  8  1.2 NAC 转录因子的研究概况  8-10    1.2.1 NAC 转录因子简介  8    1.2.2 NAC 转录因子的生物学功能  8-9      1.2.2.1 调节植物生长发育  8-9      1.2.2.2 应答生物和非生物胁迫  9    1.2.3 NAC 转录因子的表达调控  9-10      1.2.3.1 NAC 转录因子的转录水平调控  9-10      1.2.3.2 转录后调控  10      1.2.3.3 翻译后调控  10  1.3 烟碱的生物合成  10  1.4 影响烟碱合成的胁迫因素  10-112. 引言  11-123. 材料与方法  12-24  3.1 材料、试剂与仪器  12    3.1.1 材料  12    3.1.2 菌株、载体与主要试剂  12    3.1.3 主要仪器  12  3.2 实验方法  12-24    3.2.1 总RNA 的提取  12-13    3.2.2 cDNA 第一链的制备  13    3.2.3 实时荧光定量PCR 检测SSH 文库差异表达基因  13-14    3.2.4 烟草NtNAC-R1 基因的克隆  14-15    3.2.5 克隆载体pMD19-T-NtNAC-R1 的构建  15-16      3.2.5.1 连接  15-16      3.2.5.2 转化  16    3.2.6 烟草NtNAC-R1 的序列分析  16-17    3.2.7 烟草NtNAC-R1 的组织特异性表达分析  17    3.2.8 烟株打顶后24 h 内根尖组织NtNAC-R1 的表达分析  17-19      3.2.8.1 RT-PCR 检测  17      3.2.8.2 Northern 杂交检测  17-19        3.2.8.2.1 变性琼脂糖凝胶电泳分离RNA（甲醛变性胶电泳）  17-18        3.2.8.2.2 转膜和RNA 固定  18        3.2.8.2.3 探针标记  18        3.2.8.2.4 预杂交、杂交和显色  18-19    3.2.9 原核表达载体pRSETB-NtNAC-R1 的构建  19    3.2.10 NtNAC-R1 在大肠杆菌中的诱导表达  19    3.2.11 正义和反义表达载体pROK2-NtNAC-R1 构建  19-20    3.2.12 相应植物表达载体的农杆菌转化及PCR 鉴定  20-21    3.2.13 转化烟草  21-22      3.2.13.1 烟草无菌苗的准备  21      3.2.13.2 转基因烟苗的获得  21-22    3.2.14 转基因烟草分子检测  22-24      3.2.14.1 烟草转化植株的PCR 检测  22-23      3.2.14.2 RT-PCR 检测  23-244. 结果与分析  24-38  4.1 总RNA 质量的检测  24  4.2 各候选基因相对表达量分析  24-28  4.3 烟草NtNAC-R1 的克隆  28-29  4.4 克隆载体pMD19-T-NtNAC-R1 的构建  29-30  4.5 烟草NtNAC-R1 的序列分析  30-33  4.6 烟草NtNAC-R1 的组织特异性表达分析  33  4.7 NtNAC-R1 在烟株打顶后24h 内的表达谱分析  33-34  4.8 原核表达载体pRSETB-NtNAC-R1 的构建  34  4.9 NtNAC-R1 的原核表达  34-35  4.10 正义和反义表达载体pROK2-NtNAC-R1 构建  35  4.11 农杆菌PCR 检测  35-36  4.12 转基因烟草的获得  36  4.13 转基因烟草分子检测  36-38    4.13.1 烟草转化植株的PCR 检测  36-37    4.13.2 RT-PCR 检测  37-385. 结论与讨论  38-42  5.1 结论  38-39  5.2 讨论  39-42参考文献  42-47Abstract  47-48

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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