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鹰嘴豆热激转录因子CarHSFB2的克隆与功能验证

作　者: 成慧颖
导　师: 麻浩
学　校: 南京农业大学
专　业: 遗传学
关键词: 鹰嘴豆 热激转录因子 表达分析 耐热性 干旱胁迫
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


随着全球环境的不断恶化,不良的生长环境成为影响植物生长和产量的一个重要因素。鹰嘴豆是世界第三大豆类作物,它生育期短,抗逆性强,基因组小,在挖掘抗逆关键基因和解析植物生长发育及耐逆分子机制方面拥有巨大的潜力。然而,目前该作物在分子生物学方面的研究较为缺乏。对逆境的反应是生物体的一种自我保护机制,热激转录因子HSF是植物转录因子家族中较大的一类,调控热激蛋白的表达,而热激蛋白作为分子伴侣促使其他蛋白重新折叠、稳定、组装、胞内运输和降解,对受损蛋白的修复和细胞的存活起着重要的作用。而HSF在转录水平上实现对逆境反应的调控,是一种经济而灵活的调节机制,同时由于热激转录因子处于信号传导的下游,对生物和非生物逆境都有很强的反应。目前关于热激转录因子的研究主要集中在拟南芥、水稻、番茄等少数模式作物上,而鹰嘴豆中的HSF基因的克隆与功能分析尚未有报道,本研究在鹰嘴豆中分离并克隆了一个热激转录因子CarHSFB2,广泛地进行了发育和胁迫相关的表达分析,并且通过转基因研究初步分析了CarHSFB2的功能。本研究的主要结果如下：CarHSFB2编码一个长度为267aa的蛋白,含有一个长度为87bp的内含子。系统进化树分析表明CarHSFB2属于B类HSF家族。多重序列比对发现CarHSFB2与其他植物B类HSF序列具有高度的保守功能区域和内含子插入位点。亚细胞定位实验证实了CarHSFB2定位于细胞核中,Southern blot实验表明CarHSFB2在鹰嘴豆基因组中是一个单拷贝或低拷贝的基因。利用半定量RT-PCR技术广泛地调查了CarHSFB2的表达规律,CarHSFB2在鹰嘴豆叶片的衰老过程和种子萌发以及发育过程都有明显的上调表达。同时CarHSFB2受热激胁迫、氧化胁迫、盐胁迫、干旱胁迫的诱导上调表达。在IAA处理条件下,CarHSFB2呈现上调表达的趋势,而在受到GA3和6-BA处理的鹰嘴豆中呈现下调的趋势。表明CarHSFB2基因的功能既涉及植物生长发育的调节有参与多种环境胁迫的响应。在对组成型表达的转基因拟南芥T3代种子的耐热性和抗旱能力的试验中,CarHSFB2基因的表达增强了拟南芥植株的耐热性和抗旱能力。说明在热激胁迫和干旱胁迫中CarHSFB2基因具有转录激活调节的功能,为B类HSF家族作为辅助转录激活因子的存在提供了进一步的证据。

全文目录


摘要  7-9ABSTRACT  9-11缩略词表  11-12第一章 文献综述  12-24  一、鹰嘴豆的研究概况  12-15    1 鹰嘴豆的生物学特性  12-14      1.1 鹰嘴豆的分类地位、分布与形态特征  12-13      1.2 鹰嘴豆的生长环境  13-14    2 鹰嘴豆转录因子研究概况  14-15  二、植物热激转录因子的研究概况  15-23    1 植物热激转录因子HSF的基本结构  16-18      1.1 DNA结合域(DBD)  16-17      1.2 寡聚化结构域(oligomerization domain HR-A/B)  17      1.3 核定位信号(NLS)和核输出信号(NES)结构域  17      1.4 C端激活结构域  17-18    2 植物热激转录因子的起源和分类  18    3 热激转录因子的调控机制  18-19    4 植物热激转录因子的功能  19-22      4.1 植物HSF在热逆境下的作用  19-21      4.2 植物HSF在其他逆境中的作用  21-22    5 问题与展望  22-23  三、本课题研究的目的意义及主要研究内容  23-24第二章 鹰嘴豆热激转录因子CarHSFB2基因的克隆和序列分析  24-34  1 前言  24  2 材料与方法  24-29    2.1 材料的选择与种植  24    2.2 核酸序列的克隆与测序  24-28    2.3 进化树的构建与蛋白序列比对  28-29  3 结果与分析  29-33    3.1 CarHSFB2基因的克隆  29-30    3.2 CarHSFB2基因的蛋白序列比对与同源性分析  30-33  4 小结  33-34第三章 鹰嘴豆热激转录因子CarHSFB2基因的特性研究  34-42  1 前言  34  2 材料与方法  34-37    2.1 材料的选择与种植  34    2.2 Southern blot实验  34-35    2.3 载体构建  35-37    2.4 细胞定位  37  3 结果与分析  37-40    3.1 Southern blot实验  37-38    3.2 CarHSFB2定位载体的构建  38-39    3.3 CarHSFB2的亚细胞定位  39-40  4 小结  40-42第四章 鹰嘴豆热激转录因子CarHSFB2基因的表达分析  42-48  1 前言  42  2 材料与方法  42-43    2.1 材料种植与处理  42    2.2 RNA的提取和纯化  42-43    2.3 cDNA第一链的合成  43    2.4 引物设计和PCR  43  3 结果与分析  43-46    3.1 CarHSFB2在不同发育阶段的表达  43-44    3.2 CarHSFB2在非生物胁迫和化学处理下的表达  44-46  4 小结  46-48第五章 鹰嘴豆热激转录因子CarHSFB2基因功能的研究  48-56  1 前言  48  2 材料与方法  48-50    2.1 实验材料  48    2.2 植物表达载体的构建  48    2.3 农杆菌介导拟南芥的遗传转化  48-49    2.4 转基因拟南芥植株的阳性鉴定  49    2.5 转基因植株的耐热性鉴定  49-50    2.6 转基因植株抗旱能力的鉴定  50  3 结果与分析  50-53    3.1 转CarHSFB2基因的拟南芥植株的阳性鉴定  50-52    3.2 CarHSFB2基因的表达增强拟南芥的耐热性  52    3.3 CarHSFB2基因的表达增强拟南芥的抗旱能力  52-53  4 小结  53-56全文总结  56-58参考文献  58-66攻读硕士期间发表的文章  66-68致谢  68

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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