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文昌鱼天然免疫探索：体液的调理作用以及溶菌酶基因克隆

作　者: 潘俊丽
导　师: 张士璀
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 文昌鱼补体调理作用吞噬作用鲈鱼 g型溶菌酶 c型溶菌酶 i型溶菌酶
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

补体系统是先天性免疫系统的重要成分,脊椎动物尤其是哺乳动物的补体系统作用机制已经比较清晰,而无脊椎动物的补体系统仅在头索动物文昌鱼、尾索动物海鞘、棘皮动物等少数物种中开展。文昌鱼属于头索动物,在进化地位上属于无脊椎动物到脊椎动物的过渡型,故对于补体系统的发育和进化的研究有着很重要的意义。已有研究表明文昌鱼存在补体系统,已经克隆得到的补体成分包括C3,Bf,MASP以及C6-like等。在功能上,文昌鱼体液能够通过激活补体系统的替代途径,发挥溶解红血球和病原菌的作用。但文昌鱼补体功能上是否如脊椎动物补体一样,具有调理作用尚不清楚。本论文的主要目的即是探究文昌鱼补体系统是否具有调理吞噬作用。文昌鱼具有与脊椎动物循环系统大体相似的循环系统,但是没有可以自由循环的血细胞。所以,本实验选用了鲈鱼{Lateolabrax japonicus)巨噬细胞研究文昌鱼体液的调理作用,也就是把与文昌鱼体液作用过的酵母细胞和鲈鱼巨噬细胞混合,共育后统计巨噬细胞的吞噬能力,由此来评价文昌鱼体液的调理作用。首先,酵母经文昌鱼体液孵育后与鲈鱼巨噬细胞混合进行吞噬实验,鲈鱼的巨噬细胞的吞噬能力显著提高。这说明文昌鱼体液与鲈鱼巨噬细胞之间存在相互作用,也说明文昌鱼体液具有调理吞噬的作用。文昌鱼体液的调理作用呈现明显的浓度依赖性；文昌鱼体液梯度稀释4倍后,仍然能够显著促进鲈鱼巨噬细胞的吞噬作用。将文昌鱼体液加热45℃处理30 min后(够将补体失活)再处理酵母,进行吞噬实验,发现文昌鱼体液的调理作用明显减弱。这暗示文昌鱼体液的这种调理作用可能与补体系统相关。C3是脊椎动物中补体系统中发挥调理作用的主要成分,为了验证文昌鱼补体系统中C3是否参与文昌鱼补体调理作用,利用抗原抗体反应将文昌鱼体液中的C3成分沉淀后,进行吞噬实验。结果表明用C3抗体处理过的体液,其调理吞噬作用明显减弱。同样,用Bf(替代途径激活的重要因子)抗体处理文昌鱼体液后进行吞噬实验,文昌鱼体液的调理作用也明显减弱。这些都说明文昌鱼体液的调理吞噬作用的确与补体有关。另外,用文昌鱼体液处理酵母后,从酵母表面洗脱下来的蛋白片段经电泳和Western blot检测,发现能够与C3抗体结合,说明C3的裂解片段能够结合到酵母表面,这为文昌鱼体液的调理吞噬作用是通过补体来实现提供了进一步证据。综上所述,文昌鱼体液可能是通过替代途径将补体激活,导致C3的裂解片段沉积到酵母表面,通过巨噬细胞上相应的受体的识别发挥调理吞噬作用。上述研究证明文昌鱼补体系统可以和脊椎动物(鲈鱼)巨噬细胞互作,符合并支持无脊椎动物和脊椎动物补体共同起源假设。溶菌酶是先天性免疫的重要成分,在动物界中存在三种类型：g型溶菌酶,c型溶菌酶和i型溶菌酶。文昌鱼是目前唯一兼具三种类型溶菌酶的物种,对研究溶菌酶的发生和进化有极其重要的意义。我们从文昌鱼中克隆了全长为1014 bp的g型溶菌酶(AmpLyz-g),其开放阅读框为801 bp,编码266个氨基酸。该蛋白序列经Signal P 3.0 server预测,发现其氨基端有15个氨基酸组成的信号肽。经Smart预测其结构域,文昌鱼AmpLyz-g含有g型溶菌酶共有的结构域STL(如图3-11)及三个可能的的催化位点(E153,E187以及D178)。AmpLyz-g与鱼类的g型溶菌酶蛋白序列的一致性很高,可达到50%以上,与哺乳动物一致性则相对较低,仅30%左右。文昌鱼的g型溶菌酶蛋白序列由七个外显子编码,前三个外显子不包含任何结构域,后四个外显子与脊椎动物的四个外显子一一对应,且内含子插入类型也完全一致。从文昌鱼中克隆到了两个i型浴菌酶(AmpLyz-i) cDNA全长,较长i型溶菌酶的为全长1053 bp的,较短的cDNA全长849 bp,其开放阅读框为501bp,编码167个氨基酸,且这两个序列开放阅读框序列一致。该蛋白包括一个i型溶菌酶的保守结构域destabilase及三个保守的催化位点(Glu36,Asp49以及Asn120)。AmpLyz-i与同为后口动物的棘皮动物i型溶菌酶序列的一致性很高,可达到60%左右。文昌鱼Lyz-i与节肢动物一致性比较低,不到30%。系统进化分析表明,三类溶菌酶各自聚为一簇,g型和i型溶菌酶聚为一枝,与c型溶菌酶形成姐妹枝。c型溶菌可能是三种动物型溶菌酶中较为原始的一支。文昌鱼三种类型的溶菌酶的位置与其进化地位基本一致。

全文目录

摘要  4-7
英文摘要  7-12
第一章综述  12-36
  1.0 文昌鱼简介  12-13
  1.1 先天性免疫  13-17
  1.2 补体系统  17-27
    1.2.1 补体系统简介  17-18
    1.2.2 补体途径的激活  18-20
    1.2.3 补体系统的功能  20-21
    1.2.4 补体系统的调节机制  21-22
    1.2.5 关键分子——C3  22-24
    1.2.6 低等生物的补体系统  24-26
    1.2.7 文昌鱼的补体系统的研究进展  26-27
  1.3 溶菌酶  27-36
    1.3.1 引言  27
    1.3.2 溶菌酶的分类  27-28
    1.3.3 溶菌酶的作用机制  28-30
    1.3.4 c型溶菌酶  30-31
    1.3.5 g型溶菌酶  31-32
    1.3.6 i型溶菌酶  32-33
    1.3.7 研究进展与热点  33-36
第二章文昌鱼补体的调理作用  36-51
  2.1 引言  36
  2.2 材料和方法  36-45
    2.2.1 试剂和耗材  36-37
    2.2.2 FITC标记酵母  37-38
    2.2.3 鲈鱼(Lateolabrax japonicus)巨噬细胞的分离  38-40
    2.2.4 文昌鱼(Branchiostoma japonicum)体液的提取  40
    2.2.5 文昌鱼体液的调理作用  40-41
    2.2.6 体液浓度对调理作用的影响  41
    2.2.7 加热对文昌鱼体液调理作用的影响  41-42
    2.2.8 C3抗体对文昌鱼体液调理作用的影响  42
    2.2.9 Bf抗体对文昌鱼体液调理作用的影响  42
    22.10 Western blot检测C3片段与酵母的结合  42-44
    2.2.11 统计学分析  44-45
  2.3 结果  45-49
    2.3.1 鲈鱼巨噬细胞的分离  45
    2.3.2 文昌鱼体液的调理作用  45-46
    2.3.3 体液浓度对调理作用的影响  46-47
    2.3.4 加热对文昌鱼体液调理作用的影响  47
    2.3.5 C3抗体对文昌鱼体液调理作用的影响  47-48
    2.3.6 Bf因子对文昌鱼体液调理作用的影响  48
    2.3.7 Western blot检测C3片段与酵母的结合  48-49
  2.4 讨论  49-51
第三章文昌鱼g型、i型溶菌酶基因的克隆、分析  51-80
  3.1 引言  51
  3.2 材料和方法  51-66
    3.2.1 试剂和耗材  51
    3.2.2 成体文昌鱼总RNA的提取  51-52
    3.2.3 反转录cDNA  52-54
    3.2.4 克隆文昌鱼Lyz-g和Lyz-i cDNA片段  54-58
    3.2.5 利用RACE技术克隆文昌鱼Lyz-g、Lyz-i的5’和3’cDNA末端  58-64
    3.2.6 克隆文昌鱼Lyz-g和Lyz-i cDNA全长  64-65
    3.2.7 序列比对及系统进化分析  65-66
  3.3 结果  66-78
    3.3.1 文昌鱼全鱼RNA的提取  66
    3.3.2 文昌鱼Lyz-g和Lyz-icDNA片段的扩增  66-67
    3.3.3 文昌鱼Lyz-g和Lyz-i基因3’端序列扩增  67-68
    3.3.4 文昌鱼Lyz-g和Lyz-i基因5’端序列扩增  68-69
    3.3.5 文昌鱼Lyz-g和Lyz-i cDNA全长的扩增  69-70
    3.3.6 文昌鱼g型溶菌酶(AmpLyz-g)序列分析  70-74
    3.3.7 文昌鱼i型溶菌酶(AmpLyz-i)序列分析  74-77
    3.3.8 系统进化分析  77-78
  3.4 讨论  78-80
总结  80-81
参考文献  81-91
附录  91-93
致谢  93-94
个人简历  94
发表的学术论文  94

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