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人表皮细胞β1整合素启动子活性分析和钙对β1整合素启动子活性及表达影响的研究

作　者: 杜广刚
导　师: 罗向东
学　校: 第三军医大学
专　业: 外科学
关键词: 整合素β1 启动子 HaCaT 钙 EMSA
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


研究背景皮肤表皮和附件是人体的保护屏障,防止脱水和外界微生物的侵害,为了抵御外界的物理损伤,皮肤经历持续的自我更新及创面修复,以维持内环境的稳定。皮肤之所以能修复创伤并维持内环境稳态,是因为损伤后具有修复表皮的表皮干细胞,表皮干细胞存在于人的毛囊,皮脂腺和表皮。表皮干细胞具有强大的增殖潜能,包括自我永生和产生分化的表皮细胞来构成皮肤组织。近来科研工作者已经揭开表皮干细胞具有强大的增殖和分化特性,并试图解释其为何具有如此强大的增殖和分化潜能。β1整合素在表皮干细胞高表达,被认为是表皮干细胞的标志物之一,大量研究表明,β1整合素在表皮干细胞增殖和分化中发挥着至关重要的作用。表皮干细胞主要存在表皮基底层及毛囊隆突部,β1整合素在此高表达,表皮干细胞主要通过β1整合素与基底膜的粘附以及双向跨膜信号转导维持其干细胞特性,通过各种方法下调β1整合素后发现,表皮干细胞走向终末分化。因此通过β1整合素的调控维持着皮肤的完整性和内环境稳定。钙离子在表皮内环境稳定中发挥着重要作用,在正常皮肤中存在着钙离子梯度,在表皮基底层细胞钙离子浓度较低,约0.5mmol/L而在表皮颗粒层钙离子浓度明显升高,约1.4mmol/L.大量文献证实皮肤正常钙离子梯度影响角质化细胞增殖和分化。Piero C等利用MG-63细胞株(人骨肉瘤细胞株)研究证实β1整合素转录是由两个独立的启动子区调控,揭示了β1整合素转录调节模式的复杂性,而整合素β1的结构特点即:高GC含量,缺少TATA box和CCAAT box,存在多个GC-box,不同于管家基因的启动子区结构特点。近端和远端启动子在正常或刺激因素作用下都能促进转录。尽管作为转录起始的两个独立启动子促进β1整合素基因表达,产生两种mRNA,但编码序列却没变化,从而具有相同的编码序列。然而β1整合素在表皮干细胞的转录调控机制到目前为止尚不清楚。人表皮细胞株(Human adult skin keratinocytos ,HaCaT)来源于正常成人皮肤,是具有完整的表皮分化能力的永生化细胞株。研究表明,将HaCaT移植到裸鼠上,HaCaT可以形成分化上皮组织,表达特异性分化蛋白标志,因此HaCaT可以作为研究人表皮细胞分化调控的理想模型。研究目的本研究应用β1整合素启动子荧光素酶报告基因系统,以HaCaT细胞为模型,确定表皮细胞中β1整合素启动子的高转录活性区域,为进一步研究调节表皮干细胞增殖与分化的信号转导机制奠定基础。研究方法1.利用本实验室前期构建的整合素β1启动子全长、远端和近端及远端系列截短载体转染HaCaT细胞,检测它们在HaCaT中的相对荧光素酶活性,确定β1整合素启动子中的高活性启动序列范围及进行钙处理后研究其对β1整合素启动子活性和表达的影响。2.进行电泳迁移率分析(EMSA)确定并结合蛋白组学方法确定调节β1整合素启动子可能的高转录活性位点及参与转录调控的转录因子。研究结果1.β1整合素启动子在表皮细胞高转录活性区域位于远端启动子区的-352bp ~-212bp之间。2.经电泳迁移率分析证明在β1整合素远端启动子区-352bp ~-212bp之间存在特异性转录因子与其结合,结合蛋白组学方法及转录因子预测系统表明,Sp1和MAZ可能协同调节β1整合素的启动子活性。3.钙影响β1整合素启动子活性和β1整合素表达。钙影响表皮细胞迁移可能通过β1整合素。研究结论1.通过对β1整合素全长、远端与近端启动子在表皮细胞的相对荧光素酶活性分析证明β1整合素远端启动子在表皮细胞β1整合素转录调控中起主要作用。2.通过对β1整合素远端启动子系列缺失载体在表皮细胞的相对荧光素酶活性分析证明β1整合素启动子在表皮细胞高转录活性区域位于远端启动子区的-352bp ~-212bp之间。3.钙调节β1整合素启动子活性和β1整合素表达。钙调节表皮细胞迁移通过β1整合素。

全文目录


英文缩略词索引  4-6
英文摘要  6-9
中文摘要  9-11
论文正文 人表皮细胞β1整合素启动子活性分析和钙对β1整合素启动子活性及表达影响的研究  11-57
  前言  11-13
  第一部分 整合素β1 全长、远端和近端启动子及系列截短荧光素酶报告基因活性分析  13-21
    实验材料  13-15
    实验方法  15-18
    结果  18-21
  第二部分 电泳迁移率分析(Electrophoretic mobility shift assay ，EMSA)结合蛋白组学方法确认并鉴定与DNA 片段特异性结合的转录因子  21-45
    实验材料  21-24
    实验方法  24-34
    实验结果  34-41
    讨论  41-45
  第三部分 钙对integrinβ1 启动子活性和表达及表皮细胞迁移的影响  45-53
    实验材料  45-47
    实验方法  47-48
    结果  48-51
    讨论  51-53
  全文小结  53-54
  致谢  54-55
  参考文献  55-57
文献综述整合素β1 的研究进展  57-68
  参考文献  62-68
攻读硕士学位期间发表论文  68

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学
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