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黑林1号杨转双价抗虫基因的研究

作　者: 宋爽
导　师: 王志英
学　校: 东北林业大学
专　业: 森林保护学
关键词: 黑林1号杨 蜘蛛杀虫肽+Bt基因 遗传转化 农杆菌介导法
分类号: S792.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


黑林1号杨((P. simonii×P. nigra)×P.15ACL)是以小黑杨为母本、波兰15A为父本的人工杂种。该品种(系)根系发达、生长迅速、抗旱耐寒、适应性强,已成为黑龙江省等东北地区推广的优良杨树品种。但杨树害虫一直是影响其生长的主要生物因素,给林业生产、城市绿化和生态建设造成严重的威胁和巨大的经济损失。基因工程育种手段将外源抗虫基因导入林木,培育抗虫性新品种为林木害虫可持续防治提供了一条新途径。本研究以黑林1号杨为受体材料,通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法,将蜘蛛杀虫肽+Bt毒蛋白的嵌合基因导入受体细胞中,获得具有抗虫能力的优良抗性树种。主要研究结果如下：1.建立了黑林1号杨最佳组培扩繁体系,以WPM+IBA 0.2mg/L+20g/L蔗糖+5.6g/L琼脂(pH5.6)为生根培养基,以MS+6-BA 0.3mg/L+NAA 0.1mg/L+20g/L蔗糖+5.6g/L琼脂(pH 5.6)为叶片分化培养基,对黑林1号杨进行组织培养及扩繁。2.通过黑林1号杨抗生素敏感性和头孢噻肟钠对农杆菌生长影响的检测,综合分析后确定了叶片转化过程中卡那霉素和头孢噻肟钠的适宜浓度分别为15mg/L和600mg/L；在抗性芽茎段生根筛选阶段,生根培养基中卡那霉素和头孢噻肟钠的适宜浓度分别为25mg/L和700mg/L。3.建立了农杆菌介导蜘蛛杀虫肽+Bt毒蛋白的嵌合基因转化的黑林1号杨优化遗传转化体系：预培养时间为3d、菌液浓度为OD600=0.1、侵染时间为3min、共培养基中乙酰丁香酮的浓度为200μmol/L,共培养3d,延后选择培养的适宜时间为3d。4.以生长约20d左右的黑林1号杨健康组培苗叶片为受体材料,利用优化的遗传转化体系对638个叶片进行农杆菌介导,获得8株抗性芽。通过PCR分子检测,有3株抗性芽出现了特异性扩增条带,阳性率为37.5%。通过PCR-Southern印迹杂交的进一步分子检测,3株均出现了特异性的杂交条带,转化率为0.47%,进一步证明了,目的基因已经整合到黑林1号杨基因组内。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-8
1 绪论  8-15
  1.1 引言  8
  1.2 杨树抗虫基因研究现状  8-11
    1.2.1 Bt基因  8-9
    1.2.2 植物凝集素基因(Lec)  9-10
    1.2.3 蛋白酶抑制剂基因(PI)  10-11
    1.2.4 昆虫神经毒素基因(AlIT)  11
  1.3 植物遗传转化技术  11-13
    1.3.1 农杆菌介导转化法  11-12
    1.3.2 PEG法  12
    1.3.3 基因枪法  12-13
    1.3.4 花粉管通道法  13
  1.4 乙酰丁香酮  13
  1.5 研究的意义和目的  13-15
2 黑林1号杨组培体系的建立  15-23
  2.1 引言  15
  2.2 材料  15-17
    2.2.1 植物材料  15
    2.2.2 植物培养基  15-16
    2.2.3 细菌培养基  16
    2.2.4 药品与试剂  16
    2.2.5 主要仪器设备  16-17
  2.3 方法  17-18
    2.3.1 分化培养基筛选  17
    2.3.2 生根培养基筛选  17
    2.3.3 头孢噻肟钠对根癌农杆菌LBA4404生长的影响  17-18
    2.3.4 抗生素浓度的测定  18
  2.4 结果与分析  18-21
    2.4.1 分化培养基最佳激素浓度的筛选  18
    2.4.2 生根培养基最佳激素浓度的筛选  18-19
    2.4.3 头孢噻肟钠对根癌农杆菌LBA4404生长的影响  19
    2.4.4 卡那霉素浓度与叶片分化率和出芽率的关系  19-20
    2.4.5 头孢噻肟钠对叶片分化的影响  20
    2.4.6 卡那霉素对茎段生根的影响  20-21
    2.4.7 头孢噻肟钠对茎段生根的影响  21
  2.5 本章小结  21-23
3 根癌农杆菌介导的黑林1号杨遗传转化  23-31
  3.1 引言  23
  3.2 材料  23-24
    3.2.1 工程菌  23
    3.2.2 培养基  23
    3.2.3 抗生素和乙酰丁香酮的配制  23-24
    3.2.4 仪器与设备  24
  3.3 方法  24-26
    3.3.1 根癌农杆菌介导的黑林1号杨遗传转化程序  24-25
    3.3.2 黑林1号杨转化条件  25-26
  3.4 结果与分析  26-30
    3.4.1 黑林1号杨遗传转化体系的优化  26-30
  3.5 本章小结  30-31
4 抗性植株的分子生物学检测  31-43
  4.1 引言  31
  4.2 材料  31-33
    4.2.1 植物材料与菌株  31
    4.2.2 药品与试剂  31-33
    4.2.3 仪器与设备  33
  4.3 方法  33-39
    4.3.1 黑林1号杨叶片总DNA的提取  33-34
    4.3.2 质粒的小量提取  34
    4.3.3 抗性植株的PCR检测  34-35
    4.3.4 抗性植株的PCR-Southern杂交  35-39
  4.4 结果与分析  39-42
    4.4.1 黑林1号杨叶片总DNA的提取  39
    4.4.2 质粒DNA的提取与回收  39-40
    4.4.3 转化植株目的基因的PCR检测  40-41
    4.4.4 抗性植株的PCR-Southern分子杂交检测  41-42
  4.5 本章小结  42-43
结果与讨论  43-44
参考文献  44-48
附录图 A  48-49
附录图 B  49-50
附录图 C  50-51
附录图 D  51-52
附录图 E  52-53
附录图 F  53-54
攻读学位期间发表的学术论文  54-55
致谢  55-56

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中图分类: > 农业科学 > 林业 > 森林树种 > 阔叶乔木 > 杨
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