学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

牛乳β-乳球蛋白过敏原表位串联体的表达

作　者: 韩婷
导　师: 陈红兵
学　校: 南昌大学
专　业: 食品科学
关键词: β-乳球蛋白 表位串联体 表达 牛乳过敏
分类号: TS252.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 72次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


牛乳过敏是一种常见的食物过敏反应,其中β-乳球蛋白是公认的主要乳过敏原之一,大约82%的牛乳过敏患者对β-乳球蛋白过敏。另外,表位是引发食物过敏的物质基础,对食物过敏原表位的探索是食物过敏研究的重要组成部分。因此,开展牛乳p-乳球蛋白表位的研究具有重要意义。此外,本研究将p-乳球蛋白表位构建成表位串联体,优化组合的串联体将具有独立的抗原性,在基于食物过敏原表位检测的研发中具有潜在的应用价值。本论文工作研究内容包括牛乳p-乳球蛋白线性表位串联体的分子设计,表位串联体在原核系统中的表达及纯化,抗表位串联体多克隆抗体的制备及表位串联体的抗原性和过敏原性评估。研究的主要方法、结果及结论如下：1.以牛乳p-乳球蛋白与人血清IgE结合的7个B细胞线性表位(B1,B2,B3,B4,B5,B6,B7)和1个T细胞表位(T)为研究对象,选择适当的间隔序列将其串联。理论上有5040种组合方式。通过DNAStar及SOMPA网络服务器筛选合适的组合方式,使构建的串联体中各表位具有独立的抗原性。B细胞表位之间的间隔序列为甘氨酸(G),T细胞与B细胞表位之间的间隔序列是两个赖氨酸(KK)。最后设计出的串联体分子组合结构为T-K-K-B1-G-B6-G-B5-G-B3-G-B7-G-B2-G-B4。2.在设计好的串联体分子两端分别加上酶切位点BamHI和EcoRI后进行基因合成,合成的基因克隆到载体pMD19-T中。经过双酶切、连接、转化等步骤,成功构建了表达载体pGEX-4T-1-串(pGEX-4T-1-tan),并转化到表达菌株E.coliBL21 (DE3)pLysS中。3.构建好的载体经IPTG诱导表达,表达出的蛋白为串联体融合蛋白,分子量约为39.5kD。经过SDS-PAGE和Western blotting鉴定,表达结果正确。同时通过对诱导温度、时间及IPTG浓度的优化,得到目的蛋白可溶性表达的最佳条件为：23℃诱导4h,IPTG浓度为0.3mmo1／L。表达的蛋白带有GST标签,纯化后其蛋白浓度为4mg／ml。4.以纯化的串联体融合蛋白为抗原,按常规的免疫程序对两只日本大白耳兔进行免疫,间接ELISA检测结果表明,纯化的串联体蛋白具有良好的抗原性,日本大白耳兔对其具有很好的免疫应答。得到的抗体效价分别1：128,000和1：64,000。通过间接ELISA及免疫印迹实验,结果表明本实验纯化的串联体蛋白与牛乳β-乳球蛋白存在较强的免疫交叉反应。5.用牛乳过敏患者血清检测串联体融合蛋白的过敏原性,结果显示串联体融合蛋白具有一定的过敏原性。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-12
第一章 综述  12-22
  1.1 前言  12
  1.2 β-乳球蛋白的结构特征  12-13
  1.3 β-乳球蛋白的稳定性  13-15
    1.3.1 温度对β-乳球蛋白稳定性的影响  14
    1.3.2 pH对β-乳球蛋白稳定性的影响  14
    1.3.3 金属离子对β-乳球蛋白热稳定性的影响  14
    1.3.4 糖基化修饰对β-乳球蛋白稳定性的影响  14-15
    1.3.5 其它因素的影响  15
  1.4 β-乳球蛋白的生理特性  15-16
  1.5 过敏原表位  16-18
    1.5.1 表位定位研究方法  17-18
  1.6 β-乳球蛋白的过敏原性  18-20
    1.6.1 β-乳球蛋白表位  18-19
    1.6.2 加工对β-乳球蛋白过敏性的影响  19-20
  1.7 表位疫苗  20-21
  1.8 立题背景与研究内容  21-22
    1.8.1 立题背景  21
    1.8.2 研究内容  21-22
第二章 牛乳β-乳球蛋白过敏原表位串联体的分子设计  22-29
  2.1 引言  22
  2.2 实验材料  22-23
    2.2.1 牛乳β—乳球蛋白的线性表位  22
    2.2.2 计算机分析软件及服务器  22-23
  2.3 实验方法  23-24
    2.3.1 表位串联体设计的原理  23
    2.3.2 表位串联体分子组合的模式  23
    2.3.3 串联体中各表位的理论组合数  23
    2.3.4 DNAStar预测串联体B细胞线性表位  23-24
    2.3.5 SOMPA预测串联体二级结构  24
  2.4 结果与分析  24-28
    2.4.1 Genbank中牛乳β-乳球蛋白的氨基酸序列  24-25
    2.4.2 DNAStar预测串联体B细胞线性表位  25-26
    2.4.3 SOMPA预测串联体二级结构  26-27
    2.4.2 讨论  27-28
  2.5 本章小结  28-29
第三章 pGEX-4T-1-tan重组质粒的构建  29-40
  3.1 引言  29
  3.2 实验材料  29-31
    3.2.1 菌株、质粒  29
    3.2.2 工具酶、分子量Marker及主要生化试剂  29-30
    3.2.3 主要仪器与设备  30-31
    3.2.4 常规培养基及溶液的配制  31
  3.3 实验方法  31-35
    3.3.1 基因合成  31
    3.3.2 菌株培养  31-32
    3.3.3 高纯度质粒小量提取方法  32
    3.3.4 质粒的限制性双酶切  32-33
    3.3.5 回收酶切后的DNA片段  33
    3.3.6 目的基因与载体的连接  33-34
    3.3.7 大肠杆菌E.coliBL21(DE3)pLysS感受态细胞的制备  34
    3.3.8 连接产物转化感受态细胞  34-35
    3.3.9 表达载体pGEX-4T-1-tan的鉴定  35
  3.4 结果与分析  35-38
    3.4.1 设计的酶切位点  35-36
    3.4.2 pMD19-T-tan的酶切鉴定  36-37
    3.4.3 表达载体的鉴定  37-38
  3.5 讨论  38-39
    3.5.1 大肠杆菌表达系统  38-39
    3.5.2 密码子的选择  39
  3.6 本章小结  39-40
第四章 重组质粒在原核系统中的表达及表达产物的纯化  40-52
  4.1 引言  40
  4.2 实验材料  40-42
    4.2.1 主要仪器与设备  40-41
    4.2.2 常规培养基及溶液的配制  41-42
  4.3 实验方法  42-46
    4.3.1 pGEX-4T-1-tan在E.coli BL21(DE3)pLysS中的表达  42
    4.3.2 SDS-PAGE分析检测表达的融合蛋白  42-43
    4.3.3 Western blotting分析检测表达蛋白  43
    4.3.4 制备上清  43
    4.3.5 串联体融合蛋白可溶性表达的条件探索  43-44
    4.3.6 β-乳球蛋白多表位串联体融合蛋白的纯化  44-45
    4.3.7 Lowry法测蛋白浓度  45-46
  4.4 结果与分析  46-50
    4.4.1 SDS-PAGE检测结果  46
    4.4.2 Western blotting检测结果  46-48
    4.4.3 可溶性表达的最佳条件  48
    4.4.4 融合蛋白的纯化结果  48-49
    4.4.5 蛋白浓度  49-50
  4.5 讨论  50-51
    4.5.1 GST融合蛋白的表达  50
    4.5.2 蛋白的可溶性表达  50-51
    4.5.3 蛋白的亲和纯化  51
  4.6 本章小节  51-52
第五章 牛乳β-乳球蛋白表位串联体免疫特异性研究  52-64
  5.1 引言  52
  5.2 材料与设备  52-53
    5.2.1 试剂  52
    3.2.2 仪器与耗材  52
    3.2.3 溶液配制  52-53
  5.3 方法  53-57
    5.3.1 抗β-乳球蛋白多表位串联体多克隆抗体的制备  53-54
    5.3.2 牛乳过敏患者血清的来源  54
    5.3.3 方正滴定确定包被浓度和二抗稀释倍数  54-55
    5.3.4 间接ELISA测抗体效价  55
    5.3.5 方正滴定确定—抗最佳稀释倍数  55-56
    5.3.6 间接竞争ELISA  56
    5.3.7 间接ELISA法评价蛋白过敏原性  56-57
  5.4 结果与分析  57-62
    5.4.1 抗血清效价间接ELISA检测方法的建立  57
    5.4.2 免疫过程中抗体效价的变化  57-58
    5.4.3 抗原包被浓度和—抗最佳稀释倍数的确定  58
    5.4.4 β-乳球蛋白表位串联体的抗原性评估  58-61
    5.4.5 牛乳β-乳球蛋白表位串联体的过敏原性评估  61-62
  5.5 讨论  62-63
    5.5.1 多抗的制备  62
    5.5.2 抗原性评估  62-63
    5.5.3 过敏原性评估  63
  5.6 本章小结  63-64
第六章 结论与展望  64-65
  6.1 结论  64
  6.2 本研究的创新点  64
  6.3 展望与建议  64-65
致谢  65-66
参考文献  66-75
攻读学位期间的研究成果  75

相似论文

  1. 多转录因子组合调控研究,Q78
  2. 高校艺术教学建筑设计研究,TU244.3
  3. 时间表达式识别与归一化研究,TP391.1
  4. 拟南芥胱硫醚-γ-合成酶（D-AtCGS）基因在大肠杆菌中的表达及抗血清制备,Q943.2
  5. 红肉脐橙和‘国庆四号’温州蜜柑中CHS和CHI基因的克隆与表达及其对类黄酮积累的调控机制,S666.4
  6. 拟南芥热激因子HSFA1d响应甲醛胁迫的作用研究,Q945.78
  7. hBMP4和hBMP7在中国仓鼠卵巢细胞中的表达研究,Q78
  8. 南极冰藻GPx、GST和SAHH基因的克隆、定量分析及原核表达载体的构建,Q943.2
  9. 草鱼呼肠孤病毒vp5、vp7基因cDNA的克隆、表达及VP5、VP7蛋白亚细胞定位研究,S941.41
  10. 草鱼呼肠孤病毒vp6和ns38基因的克隆、表达及VP6和NS38免疫原性研究,S941.41
  11. Pin1在骨肉瘤细胞中的表达及对细胞周期的影响,R738.1
  12. BMP通路关键因子在人类牙胚组织中的表达检测,R78
  13. 《庄子》修辞策略探析,B223.5
  14. Gsα的过表达和缺失对果蝇大脑发育的影响,Q75
  15. 基于RNA测序技术的马氏珠母贝珍珠囊转录组及数字基因表达谱分析,Q786
  16. 磷酸化介导的UGT1A3代谢活性差异的初步研究,R346
  17. 军曹鱼生长激素基因（GH）的克隆和表达,Q786
  18. 稳定表达人有机阴离子转运多肽OATP1B1野生型及其突变体的HEK-293细胞系的构建,R96
  19. 论语文教师教学表达力,G633.3
  20. 条纹斑竹鲨和鲫鱼BAFF基因的克隆和性质分析,S917.4
  21. 调和玉米油对肉仔鸡抗氧化应激、脂质代谢酶及免疫基因表达的影响,S831.5

中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 乳品加工工业 > 基础科学
© 2012 www.xueweilunwen.com