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人溶菌酶乳腺生物反应器的初步研究

作　者: 张勃伟
导　师: 张涌
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 人溶菌酶增强型绿色荧光蛋白牛β-乳球蛋白乳腺上皮细胞
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

人溶菌酶(human lysozyme,hLYZ)能水解细菌细胞壁粘多糖的β-1,4糖苷键,所以对革兰阳性细菌具有直接的溶解作用,在分泌型免疫球蛋白A和补体的参与下对革兰氏阴性细菌具有间接的溶解作用,此外它还具有消炎、消肿、组织修复、改善组织局部血液循环和分解脓液等药理作用。因此在医学、食品工业等领域得到十分广泛的应用。为了防治奶牛乳房炎,提高奶牛的抗病能力,试图通过转基因动物的方法提高人溶菌酶在奶牛乳腺细胞中表达,以降低乳房炎的发病率。本研究在克隆出牛β-乳球蛋白基因5′调控序列的基础上,结合本实验室已克隆出人溶菌酶cDNA序列,构建人溶菌酶基因的乳腺特异表达载体pBEL,并通过电穿孔的方法研究其在体外培养的牛乳腺上皮细胞表达情况。通过G418筛选阳性细胞,为本实验室利用核移植技术生产转基因动物提供细胞来源。研究结果如下:1.利用PCR方法扩增了牛β-乳球蛋白基因5′调控成分,其中包括部分上游序列,第一外显子及第一内含子(933bp)。PCR产物回收纯化后,克隆在pMD18-T Vector的T位点。序列分析结果表明:该序列与牛β-乳球蛋白突变体B前体基因、牛β-乳球蛋白基因突变体B、牛β-乳球蛋白基因的同源性分别为99﹪、99﹪、98﹪。软件分析表明:该序列包括一些表达所需的调控成分,可用于构建乳腺表达载体。2.利用双酶切定向克隆的方法,将真核表达载体pEGFP-Cl构建成含有抗性基因、报告基因、人溶菌酶基因cDNA的真核表达载体pEGFP-hLYZ。用PCR和双酶切方法检测,表明插入的人溶菌酶基因位点正确无误,没有发生影响表达的突变。3.利用双酶切定向克隆的方法,将扩增的牛β-乳球蛋白基因的5′调控序列序列取代真核表达载体pEGFP-hLYZ的部分CMV作为启动子,构建人溶菌酶乳腺特异性表达载体pBEL,载体有抗性基因,绿色荧光蛋白报告基因。并且保证报告基因和目的基因为非融合型表达。4.采用电穿孔转化法转化牛乳腺上皮细胞,经过G418的初步筛选后,通过荧光显微镜观察到了绿色荧光。表明该载体是可用的。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
第一章文献综述  9-34
  1.1 奶牛乳房炎的防治进展  9-20
    1.1.1 奶牛乳房炎的分类及危害  9-10
    1.1.2 奶牛乳房炎的病因及发病规律  10-11
    1.1.3 奶牛乳房炎的诊断  11-13
    1.1.4 奶牛乳房炎的防治  13-20
  1.2 乳腺生物反应器的研究进展  20-34
    1.2.1 乳腺特异表达载体的构建  21-24
    1.2.2 影响外源基因乳腺高效表达的因素及提高的策略  24-28
    1.2.3 转基因技术的研究  28-33
    1.2.4 问题与展望  33-34
第二章牛β-乳球蛋白基因5′调控序列的克隆及序列分析  34-44
  2.1 材料与方法  34-41
    2.1.1 材料  34-37
    2.1.2 实验方法  37-41
  2.2 实验结果  41-43
    2.2.1 牛β-乳球蛋白基因5′调控序列的PCR 鉴定结果  41
    2.2.2 BamHⅠ酶切鉴定的结果  41
    2.2.3 序列分析结果  41-43
  2.3 讨论  43
  2.4 小结  43-44
第三章人溶菌酶乳腺特异表达载体的构建及其在牛乳腺上皮细胞中的表达  44-54
  3.1 材料与方法  45-49
    3.1.1 材料  45
    3.1.2 方法  45-49
  3.2 结果  49-51
    3.2.1 hLYZ 基因 PCR 扩增的结果  49
    3.2.2 phLYZ，pEGFP-C1 的 BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定结果  49
    3.2.3 重组质粒pEGFP－hLYZ 的鉴定  49-50
    3.2.4 pMD-BLG，pEGFP－hLYZ 的 SnaBⅠ和NheⅠ双酶切  50
    3.2.5 重组质粒pBEL 的鉴定  50
    3.2.6 人溶菌酶基因的细胞表达  50-51
  3.3 讨论  51-52
  3.4 小结  52-54
结论  54-55
参考文献  55-63
附录  63-65
致谢  65-66
作者简介  66

人溶菌酶乳腺生物反应器的初步研究

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