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宫内环境改变对子代大鼠神经系统学习相关受体及DNA甲基化谱的远期影响

作　者: 朱好
导　师: 李笑天；王慧君；郭奇桑；程琰；朱蔚敏；丁奕靖
学　校: 复旦大学
专　业: 妇产科学
关键词: 孕期营养不良子痫前期神经发育 NMDA受体多巴胺受体糖皮质激素受体免疫组化 Western Blot Real-time PCR CpG岛甲基化微阵列基因表达
分类号: R714.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的：探讨宫内环境改变对子代大鼠神经系统远期影响的可能机制,验证学习相关信号通路在转录及蛋白水平上差异表达,为阐明胎源性成人疾病对神经发育的远期影响提供理论和实验依据。方法：在已经成功建立孕期营养不良及子痫前期模型的基础上,取其8周龄仔鼠及孕期正常8周龄仔鼠的大脑组织作为研究对象,分别采用免疫组织化学、Western Blot、Real-time PCR的方法研究N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate NMDA)受体NNMDAR1、NMDAR2B,多巴胺受体DR1、DR2及糖皮质激素受体的定位、蛋白和mRNA水平的表达变化情况。结果：(1)免疫组化结果显示,与对照组相比孕期低蛋白饮食组NMDA受体NNMDAR1、NMDAR2B,多巴胺受体DR1、DR2受体的免疫反应阳性神经元细胞的数目及分布减少,而糖皮质激素受体蛋白则无明显差异；与对照组相比孕期子痫前期组NMDA受体NNMDAR1,多巴胺受体DR1的免疫反应阳性神经元细胞的数目及分布减少,糖皮质激素受体则增多,而多巴胺受体DR2免疫反应阳性细胞略增多伴局部阴性表达,但NMDA受体NNMDAR2B则无明显差异。(2) Western Blot结果提示孕期低蛋白饮食组NMDA受体NNMDAR1、NMDAR2B受体蛋白表达量低于对照组(P<0.05),多巴胺受体DR1、DR2及糖皮质激素受体蛋白表达与对照组相比无显著性差异；孕期子痫前期组糖皮质激素受体蛋白表达高于对照组(P<0.05), NMDA受体NNMDAR1、NMDAR2B,多巴胺受体DR1、DR2与对照组相比无显著性差异。(3) Real-time PCR结果提示孕期低蛋白饮食组NMDA受体NMDAR2B受体mRNA表达量低于对照组(P<0.05), NMDA受体NNMDAR1,多巴胺受体DR1、DR2及糖皮质激素受体mRNA表达与对照组相比无显著性差异；孕期子痫前期组糖皮质激素受体mRNA表达量高于对照组(P<0.05),NMDA受体NNMDAR1、NMDAR2B,多巴胺受体DR1、DR2受体mRNA表达与对照组相比无显著性差异。结论：孕期宫内环境改变导致NMDA受体、多巴胺受体的下调,糖皮质激素受体的上调,可能是其子代青少年时期神经系统发生障碍的发生机制。目的：探讨胎源性成人疾病影响神经系统发育的机制,在表观遗传水平上研究孕期宫内环境改变后的8周龄仔鼠大脑特异的CpG岛甲基化谱型改变。方法：在已经成功建立孕期营养不良模型模拟宫内环境改变的基础上,采用大鼠Roche-NimbleGen CpG promoter芯片,筛选孕期营养不良的8周龄子代大鼠大脑组织CpG岛甲基化差异基因,并进一步行基因本体(gene ontology, GO)和KEGG通路分析。结果：(1)通过差异基因筛选发现,孕期营养不良子代大鼠的大脑组织基因明显发生甲基化差异。18541个待选基因在CpG岛区共筛选出1181个甲基化差异基因,其中实验组发生超甲基化的基因共有542个(45.85%),发生去甲基化的基因共有639个(54.15%)；在启动子区实验组发生超甲基化的基因共有1018个(50.70%),发生去甲基化的基因共有990个(49.30%)。(2)通过G0分析,CpG岛区实验组发生去甲基化的基因中,与记忆功能相关的有1类(P=0.0029),有3类与脑组织发育相关,分别是前脑发育(P=5.58E-06),中脑发育(P=0.0032)以及神经元发育(P=0.0342),1类与神经信号肽通路相关(P=0.0047)。无论是实验组发生超甲基化(12类,22.64%)还是去甲基化(19类,13.77%),参与发育与分化的基因类别所占很大一部分比例；启动子区实验组发生去甲基化的基因中,有2类与脑组织发育相关,分别是中枢神经系统发育(P=0.0252)和大脑发育(P=0.0426),1类与神经信号肽通路相关(P=0.0042),1类与神经发生调节有关(P=0.0336)。(3)通过KEGG分析,在CpG岛区通路分析有5条差异通路,其中神经活性配体-受体相互作用信号转导通路(Neuroactive ligand-receptor interaction)甲基化差异高度相关(P=0.0028)；在启动子(promoter)区有4条差异通路,其中神经活性配体-受体相互作用信号转导通路,钙离子信号通路(Calcium signaling pathway),细胞内基质受体信号通路(ECM-receptor interaction)甲基化差异均高度相关(P值均<0.05)。结论：孕期宫内环境改变造成胚胎发育阶段表观遗传的改变,与一系列关键基因CpG岛甲基化改变有关,这些甲基化水平的差异可能是孕期宫内环境改变导致远期神经系统损害的发生机制。

全文目录

英文缩略词表  5-6
中文摘要  6-8
Abstract  8-11
前言  11-13
第一部分:宫内环境改变对子代大鼠神经系统学习相关受体的远期影响  13-40
  研究背景  13-15
  第一节:孕期低蛋白饮食对子代大鼠神经系统学习相关受体的远期影响  15-28
    1.1 实验方法  15-17
      1.1.1 标本来源  15
      1.1.2 免疫组化  15-16
      1.1.3 Western Blot  16
      1.1.4 Real-time PCR  16-17
      1.1.5 统计学分析  17
    1.2. 结果  17-28
      1.2.1 免疫组化的结果  18-21
      1.2.2 Western Blot的结果  21-24
      1.2.3 Real-time PCR的结果  24-28
  第二节:子痫前期对子代大鼠神经系统学习相关受体的远期影响  28-38
    2.1 实验方法  28
      2.1.1 标本来源  28
      2.1.2 免疫组化  28
      2.1.3 Western Blot  28
      2.1.4 Real-time PCR  28
      2.1.5 统计学分析  28
    2.2 结果  28-38
      2.2.1 免疫组化的结果  28-31
      2.2.2 Western Blot的结果  31-35
      2.2.3 Real-time PCR的结果  35-38
  讨论  38-39
  小结  39-40
第二部分:应用CpG岛芯片技术研究宫内环境改变后子代大鼠大脑组织CpG岛甲基化差异  40-56
  研究背景  40
  1 实验方法  40-42
    1.1 标本来源  41
    1.2 Roche-NimbleGen CpG promoter芯片技术  41-42
    1.3 生物信息学分析  42
  2. 实验结果  42-52
    2.1 基因芯片信号杂点图效果  42-43
    2.2 甲基化差异基因  43-51
    2.3 通路分析  51-52
  讨论  52-55
  小结  55-56
结论  56-57
参考文献  57-62
综述  62-68
致谢  68-70

宫内环境改变对子代大鼠神经系统学习相关受体及DNA甲基化谱的远期影响

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