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茶叶中有效生化成分高效液相色谱检测法的建立及其在凤凰乌龙茶检测中的应用
作 者: 王琳
导 师: 曾晓雄
学 校: 南京农业大学
专 业: 食品科学
关键词: HPLC 甲基化儿茶素 Toyopearl HW-40S SPE 凤凰乌龙茶
分类号: TS272.7
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
茶叶是数千年来上世界最受欢迎的饮料之一,中国是茶叶生产和消费大国。茶叶中含有多种有益人体健康的成分,如多酚类物质、氨基酸、生物碱等,正是这些有效生化成分通过多种途径发挥着多种有益作用,如抗氧化、抗突变、抗癌和抗过敏等。因此,针对茶叶中的有效生化成分建立快速、高效、准确的定性定量检测方法成为研究热点。近年来,产于中国广东省潮安县凤凰镇的凤凰乌龙茶,因为其香气类似天然花香并具有特殊韵味,引起国内众多学者的兴趣。目前针对凤凰乌龙茶的研究主要集中于其香气形成原因、抗氧化作用和生产管理方面,对其主要有效生化成分进行系统全面的检测分析还未见报道。因此,本实验建立了对茶叶中10种儿茶素单体、没食子酸、可可碱、咖啡碱和茶碱在15mmin内的高效液相色谱(HPLC)检测法,以及同时对茶叶中17种游离氨基酸的HPLC检测法;并将建立的方法应用于凤凰乌龙茶的检测分析。主要研究结果如下:1.通过实验室已有的儿茶素标品和甲基化儿茶素高含量茶——日本Benifuji茶,采用大孔树脂HP-20对Benifuji绿茶茶样富集得到粗茶多酚后,运用中压层析系统,80%乙醇洗脱Toyopearl HW-40S柱,对不同组分分别收集再次以同样的条件分离纯化后,得到了纯度分别为98.4%和95.3%的甲基化儿茶素EGCG3"Me和ECG3’Me(所得甲基化儿茶素的结构经1H NMR、ESI-TOF-MS分析,被证明分别与文献报道的EGCG3"Me和ECG3’Me的1H-NMR数据一致),以及纯度>97%的儿茶素单体EC、EGC、ECG和EGCG。2.将得到的较高浓度儿茶素单体EC、EGC、EGCG和ECG,加热异构化后由半制备色谱柱Zorbax SB-C18,采用AKTA purifier分离得到纯度均>98%儿茶素单体C、GC、GCG和CG。所得单体结构也均经过1H-NMR、ESI-TOF-MS分析证明。3.采用OPA(邻苯二甲醛)柱前衍生化HPLC检测,建立了17种游离氨基酸检测的定性和定量方法;采用SPE(固相萃取)柱处理茶汤,吸附了茶汤中大部分多酚类物质,从而去除了其对氨基酸检测时的影响,并设计实验证明了SPE处理法的可行性和有效性。4.通过已经建立的HPLC法对11种凤凰乌龙茶中10种儿茶素、咖啡碱、可可碱、茶碱和没食子酸进行定量分析。发现凤凰乌龙茶中没食子酸、可可碱和茶碱的含量较低;咖啡碱含量比较高,与凤凰茶的生长环境有关;所有凤凰乌龙茶中的酯型儿茶素含量都很高,从侧面说明了凤凰乌龙茶的优秀品质形成条件;采用SPE处理,OPA柱前衍生化对11种凤凰乌龙茶中的17种游离氨基酸进行了定量分析。发现虽然11种茶样的氨基酸总量都比较低,所含种类和含量有较大差异,但天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、丝氨酸Ser和茶氨酸Thea仍为所有茶样中的主要氨基酸。
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全文目录
摘要 9-11ABSTRACT 11-14第一章 文献综述 14-38 1 凤凰乌龙茶的概述 14-15 1.1 我国凤凰乌龙茶的产业现状 14 1.2 凤凰乌龙茶中的主要有效生化成分 14-15 1.2.1 凤凰乌龙茶中的茶多酚 14-15 1.2.2 凤凰乌龙茶中的氨基酸 15 2 儿茶素的研究进展 15-23 2.1 儿茶素的组成 15-16 2.2 儿茶素的生理活性研究 16-18 2.2.1 抗氧化、清除自由基和抗衰老作用 16-17 2.2.2 抗癌、抗突变作用 17 2.2.3 抗过敏作用 17 2.2.4 降血脂和防治心脑血管疾病 17-18 2.2.5 抑菌和抑制病毒作用 18 2.3 儿茶素的制备技术研究现状 18-23 2.3.1 儿茶素的提取方法 18-20 2.3.1.1 有机溶剂萃取法 18-19 2.3.1.2 金属离子沉淀法 19 2.3.1.3 超临界萃取法 19-20 2.3.1.4 膜分离法 20 2.3.2 儿茶素的纯化方法 20 2.3.3 20-23 2.3.3.1 柱色谱法 20-21 2.3.3.2 吸附树脂法 21-22 2.3.3.3 高效液相色谱法(HPLC) 22 2.3.3.4 高速逆流色谱法(HSCCC) 22-23 2.4 儿茶素的分析检测技术现状 23 3 茶氨酸的研究进展 23-29 3.1 茶氨酸的概述 23-24 3.2 茶氨酸的生理功能 24-27 3.2.1 松弛神经紧张和放松作用 24 3.2.2 对脑神经保护作用 24-25 3.2.2.1 体外实验 24 3.2.2.2 体内实验 24-25 3.2.3 对血压的影响 25 3.2.4 辅助抑制肿瘤 25-26 3.2.5 降脂作用 26 3.2.6 增强记忆力作用 26 3.2.7 增强免疫作用 26 3.2.8 改善经期综合症 26 3.2.9 抗衰老作用 26-27 3.3 茶氨酸的提取与合成研究进展 27-28 3.3.1 化学合成 27 3.3.2 直接提取分离 27-28 3.3.3 生物合成 28 3.4 茶氨酸的检测 28-29 3.4.1 氨基酸自动分析仪和HPLC 28-29 3.4.2 毛细管电泳法 29 4 生物碱 29-30 4.1 生物碱的概述 29-30 4.2 生物碱的检测 30 5 研究的目的、意义 30-31 参考文献 31-38第二章 高效液相色谱法同时检测10种儿茶素、咖啡碱、可可碱、茶碱和没食子酸的建立 38-54 1 材料与方法 38-41 1.1 材料 38-39 1.1.1 主要试剂、标准品和茶样 38-39 1.1.2 主要仪器与设备 39 1.2 试验方法 39-41 1.2.1 茶汤浸提 39 1.2.2 儿茶素单体EC、EGC、EGCG、ECG、EGCG3"Me和ECG3’Me的制备 39-40 1.2.2.1 大孔树脂吸附分离儿茶素 39-40 1.2.2.2 儿茶素的Toyopearl HW-40S中压色谱分离 40 1.2.3 儿茶素单体C、GC、GCG、和CG的制备 40 1.2.4 儿茶素单体的结构鉴定(1H NMR和ESI-TOF-MS分析) 40-41 1.2.5 HPLC-DAD检测 41 1.2.6 标准曲线的绘制和检测方法精密度考察 41 1.2.6.1 标准曲线的绘制 41 1.2.6.2 回收率实验 41 1.2.6.3 精密度实验和重现性实验 41 2 结果分析 41-49 2.1 儿茶素EC,EGC,EGCG,ECG ECG3’ME和EGCG3"ME的分离纯化及结构鉴定 41-45 2.2 HPLC-DAD同时检测十种儿茶素、咖啡碱、可可碱、茶碱和没食子酸 45 2.3 高效液相色谱方法的定量分析 45-47 2.3.1 十种儿茶素、三种生物碱和没食子酸标品的标准曲线、线性范围和最小检测限 45-46 2.3.2 回收率实验、精密度实验和重现性实验 46-47 2.4 不同茶样高效液相色谱法检测结果分析比较 47-49 3 本章小结 49-51 参考文献 51-54第三章 柱前衍生化检测茶叶中17种游离氨基酸的方法建立 54-70 1 材料与方法 54-57 1.1 材料 54-55 1.1.1 主要试剂、标准品和茶样 55 1.1.2 主要仪器与设备 55 1.2 试验方法 55-57 1.2.1 茶叶浸提液的制取 55 1.2.2 衍生化OPA试剂的配置 55 1.2.3 Waters Sep-Pak Catridges的活化 55 1.2.4 茶汤SPE处理 55-56 1.2.5 OPA柱前衍生化 56 1.2.6 色谱条件 56 1.2.7 HPLC检测方法精密度考察 56-57 1.2.7.1 标准曲线的绘制 56 1.2.7.2 回收率实验 56-57 1.2.8 SPE方法可行性和有效性实验 57 1.2.8.1 可行性实验 57 1.2.8.2 有效性实验 57 2 结果与分析 57-66 2.1 HPLC-DAD同时检测17种氨基酸标准品及HPLC定量分析 57-59 2.2 SPE方法可行性和有效性实验结果分析 59-63 2.2.1 SPE方法的回收率 59-61 2.2.2 SPE方法有效性实验结果 61-63 2.3 不同茶样中游离氨基酸的测定结果分析 63-66 3 本章小结 66-67 参考文献 67-70第四章 凤凰乌龙茶中主要有效生化成分的检测分析 70-78 1 材料与方法 70-72 1.1 材料 70-71 1.1.1 主要试剂、标准品和茶样 70 1.1.2 主要仪器与设备 70-71 1.2 方法 71-72 1.2.1 10种儿茶素、咖啡碱、可可碱、茶碱的HPLC-DAD检测 71 1.2.1.1 茶样的浸提 71 1.2.1.2 HPLC-DAD分析 71 1.2.2 17种游离氨基酸的柱前衍生化和HPLC-DAD检测 71-72 1.2.2.1 茶汤的浸提 71 1.2.2.2 OPA衍生化试剂的配置和SPE小柱的活化 71 1.2.2.3 茶汤SPE处理 71-72 1.2.2.4 OPA柱前衍生化和HPLC检测 72 2 结果与分析 72-76 2.1 不同种凤凰乌龙茶中10种儿茶素、咖啡碱、可可碱、茶碱的HPLC-DAD检测结果 72-74 2.2 不同种凤凰乌龙茶中17种游离氨基酸HPLC检测结果 74-75 2.3 不同种凤凰乌龙茶的酚氨比 75-76 3 本章小结 76-77 参考文献 77-78全文结论 78-80创新点 80-82致谢 82-84攻读硕士学位期间取得的研究成果 84
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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 饮料冷食制造工业 > 茶 > 产品标准与检验
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