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Bhlhb5、SoxE与Necl-1在神经发育和分化中的作用

作　者: 刘奔
导　师: 强伯勤；邱猛生；袁建刚；彭小忠
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: Bhlh Sox基因家族 Necl-1 神经发育转录调控细胞粘附分子基因敲除
分类号: Q42
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

脊椎动物的中枢神经系统(CNS)是非常复杂并具有高度组织性的系统，细胞的多样性是神经系统的显著特征之一。尽管神经元和胶质细胞都具有重要功能，但目前对其发育和分化的具体机制仍不清楚。已知在神经系统发育和功能形成过程中，需要众多转录因子和细胞粘附分子共同作用。在本研究中，我们主要利用功能获得和功能缺失方法，对转录因子Bhlhb5，SoxE以及细胞粘附分子Necl-1在神经元和少突胶质细胞发育中的作用进行研究。大量证据表明bHLH(basic helix-loop-helix)转录因子对神经细胞的命运决定与分化起重要调节作用。Bhlhb5即是一种bHLH转录因子，与Olig1，Olig2，Olig3和Bhlhb4一起同属于Olig家族成员。本研究中，我们利用新制备的抗Bhlhb5多克隆抗体进行免疫组织化学染色并结合BrdU标记实验，研究了Bhlhb5在脊髓发育过程中的时空表达。在脊髓(E10.5)发育早期，Bhlhb5表达于脊髓背部的dI6中间神经元及腹部的V1与V2中间神经元区域。在发育的晚期(E17.5)，Bhlhb5表达在晚期产生的背侧中间神经元，这些神经元可迁移至背部更表层的位置。BrdU标记和免疫双标记实验提示Bhlhb5阳性的dIL神经元主要产生于E12.5及之后的背部神经前体细胞。以上结果提示在E14.5至E17.5时期，Bhlhb5+的中间神经元迁移至更靠背部的细胞层中。推测Bhlhb5在脊髓发育中的中间神经元中神经递质的产生和转换相关。SoxE亚族包括Sox8，Sox9和Sox10三个蛋白分子，属于Sox(SRY相关HMG-box基因)基因编码的一个成员众多的转录因子超家族。Sox蛋白分子参与包括神经嵴，生殖腺，骨骼和中枢神经系统在内的不同发育过程。以前有关SoxE蛋白对脊髓神经发育影响的证据主要来源于对Sox功能缺失动物的研究，认为少突胶质细胞的发育过程中，SoxE蛋白呈现出功能的冗余性。在本研究中，我们采用鸡胚电穿孔方法来揭示SoxE蛋白对神经元和少突胶质细胞发育的影响。首先原位杂交实验显示了SoxE在鸡胚胎脊髓的表达模式。此结果提示Sox9与神经元和少突胶质前体细胞的产生相关，而Sox8和sox10则参与少突胶质细胞的分化决定。于鸡胚脊髓过表达Sox8和Sox9在脊髓发育的早期即可诱导少突胶质细胞的产生，并促进少突胶质细胞的分化。相反，在鸡胚脊髓过表达Sox9时，中间神经元和运动神经元标志物的表达水平也呈现下调。说明过表达Sox9可以抑制神经元的分化。为了阐明soxE蛋白之间的相互作用关系，当用电穿孔法过表达其中一个SoxE家族成员，检测其它成员的表达情况。结果提示不仅SoxE蛋白之间存在相互诱导作用，SoxE蛋白与其它在少突胶质细胞发育中起关键作用的转录因子之间都存在相互作用关系。为了分析SoxE蛋白具体的分子作用机制，将DNA结合基序HMG与VP16蛋白的激活结构域和EnR的抑制结构域相融合分别构建表达载体。在鸡胚中过表达后，发现HMG-VP16可以抑制中间神经元的生成并促进少突胶质细胞的产生和分化。此结果与全长SoxE蛋白的作用类似。但HMG-EnR过表达后，观察不到对脊髓神经发育的明显影响。说明SoxE家族转录因子对脊髓发育的影响是以转录抑制的方式起作用的。本研究提示SoxE家族分子可通过形成转录因子作用网络，调控少突胶质细胞和神经元的生产和分化决定。细胞粘附分子在中枢神经系统发育中行使重要功能，影响神经发育的不同方面，包括大脑的发生，神经干细胞的增殖和分化，突触的可塑性以及学习和记忆功能等多方面。Necl-1(TSLL1／SynCAM3)属于钙非依赖性的免疫球蛋白超家族细胞粘附分子成员。目前已知Necl-1特异地表达在神经系统，定位于神经元之间和神经元与胶质细胞之间的连接上。推测Necl-1可能参与调控神经发育过程中神经元的迁移，轴突的生长，突触的组装及髓鞘的形成。在本研究中，我们主要利用常规的基因敲除方法和鸡胚电穿孔技术研究神经发育中Necl-1的功能。原位杂交实验和免疫组织化学实验结果显示Necl-1广泛地表达于胚胎期和出生后的小鼠脊髓灰质和脑部。利用鸡胚电穿孔技术在神经管中过表达Necl-1基因，结果显示Necl-1并不影响脊髓发育早期的运动神经元和中间神经元的生成和定位。采用常规的基因打靶方法生成Necl-1突变小鼠。构建了Necl-1打靶载体，用β-半乳糖苷酶基因替代Necl-1基因组第2-5外显子，覆盖了第一个Ig样结构域和第二个Ig样结构域的一部分。之后打靶载体导入胚胎干细胞，进行同源重组。通过基因组Southern杂交实验和PCR方法筛选发生同源重组的ES阳性克隆。此克隆用于产生突变的小鼠。目前已得到Necl-1基因敲除杂合子小鼠。未来工作将集中在对纯合子突变小鼠的分析上。拟利用免疫学，逆行分析和电生理检测等方法对神经迁移，轴突生长和突触形成等方面进行检测。同时利用电镜的方法研究髓鞘形成的变化。对以上基因的研究将为了解神经系统的发育和大脑如何工作提供重要的线索。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-9
前言  9-27
实验材料  27-37
实验方法  37-57
实验结果  57-82
讨论  82-91
小结  91-93
参考文献  93-103
论文综述  103-111
附录  111-112
发表文章及会议摘要  112-113
致谢  113-115

Bhlhb5、SoxE与Necl-1在神经发育和分化中的作用

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