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猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备

作　者: 邵烈刚
导　师: 蔡家利
学　校: 西南大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白单克隆抗体
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 27次
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内容摘要

猪繁殖与呼吸综合征是一种能引起母猪繁殖障碍、新生仔猪呼吸道症状及高死亡率的传染病。该病于1987年首先暴发于美国,随后迅速向世界各地蔓延:我国郭宝清等于1996年从疑似本病的猪群中分离到PRRSV,从而确认了PRRS在我国的存在。由于基因的变异,近两年我国大部分地区暴发了以高传染性、高死亡率为特征的高致病性蓝耳病,给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。目前PRRS的确诊依赖于病毒的分离鉴定、血清学诊断方法以及分子生物学诊断方法等。血清学诊断方法包括免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、间接荧光抗体试验(IFA)、乳胶凝集试验(LAT)、血清中和试验(SN)以及酶联免疫吸附实验(ELISA)等;分子生物学诊断方法包括聚合酶链式反应(PCR)技术、核酸探针原位杂交技术(ISH)等。这些诊断方法由于检测时间较长及检测所需仪器设备较昂贵,多数不适合于临床快速诊断。近几年来兴起的免疫胶体金诊断试纸法很好的弥补了这些不足,但要想成功的开发出胶体金诊断试纸,首先必须制备高亲和力、高特异性的单克隆抗体。本实验的目的就是制备高亲和力、高特异性的抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体,为下一步开发PRRS胶体金诊断试纸建立基础。本试验利用南京农业大学已构建的含有PRRSV N蛋白基因的重组表达载体阳性菌,在37℃条件下,用终浓度1mM的IPTG诱导表达4h。经SDS-PAGE分析,表明N基因在大肠杆菌中得到了高效表达。经镍柱亲和层析纯化,获得了纯度较高、免疫学活性较好的N蛋白。以此蛋白作为抗原对BalB/C小鼠进行长程免疫,取抗体效价较高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG-1500进行融合,融合率为60.6%。建立间接ELISA方法,用于检测杂交瘤细胞上清中的单克隆抗体,初检阳性率为16.1%。经多次亚克隆及反复筛选,获得了2株能稳定分泌抗PRRSV单抗的杂交瘤细胞株,命名为4D3和15F6。将得到的单抗株进行初步鉴定,两单抗株特异性针对PRRSV共同的抗原表位。4D3和5F6杂交瘤细胞株经过反复冻存、复苏及多次传代,均能分泌较高效价的抗体,其抗体效价保持在1:1000以上;将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内诱生腹水,7天后将收集的腹水以辛酸-硫酸铵法提纯,间接ELISA检测其效价达1:102400以上。因此,上述杂交瘤细胞将会在PRRS的诊断中发挥重要的作用。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-9
第1章文献综述  9-23
  1.1 PRRSV的特征  9-13
  1.2 猪繁殖与呼吸综合征流行特征  13-15
  1.3 猪繁殖与呼吸综合征的诊断  15-20
  1.4 高致病性蓝耳病简介  20-22
  1.5 单抗在动物疫病诊治中的应用  22-23
第2章引言  23-24
第3章 PRRSV核衣壳蛋白的原核表达、纯化和鉴定  24-35
  3.1 试验材料  24-26
  3.2 试验方法  26-29
  3.3 试验结果  29-32
  3.4 讨论  32-35
第4章 PRRSV核衣壳蛋白单克隆抗体的制备  35-47
  4.1 试验材料  35-36
  4.2 试验方法  36-41
  4.3 试验结果  41-44
  4.4 讨论  44-47
第5章结论  47-48
参考文献  48-53
致谢  53-54
攻读硕士期间论文发表情况  54-55
附录1 英文缩略词表  55-56
附录2 溶液的配制  56-57

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备

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