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呼吸道合胞病毒重组融合蛋白TB10.4-F1免疫原性和安全性的研究

作　者: 王瑞博
导　师: 井申荣
学　校: 昆明理工大学
专　业: 微生物学
关键词: 呼吸道合胞病毒 TB10.4-F1 TB10.4 LT
分类号: R725.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus, RSV)是全世界范围内引起婴幼儿下呼吸道感染最重要的病原体,容易诱发毛细支气管炎、肺炎,甚至导致死亡。迄今为止,仍然没有一种安全有效的疫苗来预防RSV感染。在本研究中,将呼吸道合胞病毒F1蛋白与结核分枝杆菌TB10.4蛋白在大肠杆菌中进行了融合表达,并辅以粘膜佐剂无毒型大肠杆菌热不稳定肠毒素(E.coli heat-labile enterotoxin, LT)后免疫BALB/c小鼠,以此来分析和评价融合蛋白的免疫原性及其安全性。为获得重组TB10.4-F1融合蛋白,构建了TB10.4-F1/pET30a重组载体,同时构建TB10.4/pET28a载体以作对照。转化大肠杆菌后成功表达出了含有His标签的TB10.4-F1蛋白和TB10.4蛋白。anti-His作一抗Western-blot鉴定重组蛋白正确。大量诱导表达并获得目的蛋白的包涵体之后,在变性条件下用镍亲和层析的方法一步纯化,纯化后TB10.4-F1和TB10.4的纯度分别达到80%和95%。将纯化后的TB10.4-F1蛋白、TB10.4蛋白分别与LT混合后免疫BALB/c小鼠,设立PBS组；LT组；TB10.4组；TB10.4-F1组；TB10.4-F1+LT组,共5组,每组5只,按照0、2、4周免疫程序免疫。免疫周期结束后处死测定各项指标。结果表明：1)TB10.4-F1组和TB10.4-F1+LT组的特异性IgG水平显著高于其它对照组,说明融合蛋白可以刺激产生高水平的血清抗体；2)与TB10.4组相比,TB10.4-F1组和TB10.4-F1+LT组的IgGl/IgG2a比值更接近1,T细胞免疫反应较为平衡；3)肺组织病理切片表明,TB10.4-F1融合蛋白具有一定的免疫毒性,会造成肺组织中毛细血管扩张,嗜酸粒细胞增多；4)TB10.4组IgG1/IgG2a比值大于1,代表Th2型反应占优势。随后按同样分组免疫小鼠,免疫周期结束后,用3×105pfu的RSV滴鼻攻击免疫后的小鼠,5天之后处死测定各项指标。结果表明：1)攻毒后,TB10.4-F1+LT组和TB10.4-F1组小鼠体重下降迅速,特别是TB10.4-F1+LT组小鼠在处死前由于呼吸衰竭已死亡3只；2)TB10.4-F1+LT组和TB10.4-F1组的呼吸道灌洗液中均有IgA反应,并且TB10.4-F1+LT组IgA值又明显大于TB10.4-F1组(P<0.05),说明LT的加入可以促进呼吸道粘膜处产生分泌型IgA；3)肺组织病理切片表明,攻毒后TB10.4-F1+LT组和TB10.4-F1组小鼠机体会引发严重的免疫毒理反应,说明重组TB10.4-F1蛋白存在免疫毒性,不仅没有保护作用,反而会加重小鼠病情。本实验初步探讨了融合蛋白TB10.4-F1的免疫原性及其安全性,为以后新型RSV疫苗的研发提供了理论依据。

全文目录


摘要  4-6ABSTRACT  6-8目录  8-12插图和附表清单  12-13缩略语索引  13-14第一章 引言  14-19  1.1 呼吸道合胞病毒简介  14-15    1.1.1 呼吸道合胞病毒感染  14    1.1.2 呼吸道合胞病毒基本特征  14-15  1.2 F蛋白的功能与结构  15-16  1.3 F蛋白亚单位疫苗的研究及其存在的问题  16  1.4 本文F蛋白亚单位疫苗的设计思路  16-19    1.4.1 在大肠杆菌中截短表达F蛋白  16-17    1.4.2 用Th1型免疫反应抗原以纠正F蛋白的免疫极化特性  17    1.4.3 提高F蛋白粘膜免疫性  17-19第二章 TB10.4和F1基因的克隆  19-28  2.1 材料和方法  19-24    2.1.1 材料  19-22    2.1.2 方法  22-24  2.2 结果  24-26    2.2.1 TB10.4(Nde Ⅰ/BamH Ⅰ)基因和F1(BamH Ⅰ/Xho Ⅰ)基因的扩增  24-25    2.2.2 TB10.4(Nde Ⅰ/Xho Ⅰ)基因的扩增  25-26  2.3 讨论  26-27    2.3.1 原核表达引物设计的策略  26    2.3.2 PCR扩增体系中DNA聚合酶的选择  26    2.3.3 结核分枝杆菌的TB10.4基因的扩增  26-27  2.4 小结  27-28第三章 重组表达载体TB10.4-F1/pET30a的构建  28-42  3.1 材料和方法  28-35    3.1.1 材料  28-30    3.1.2 方法  30-35  3.2 结果  35-40    3.2.1 重组亚克隆载体的鉴定  35-37    3.2.2 重组克隆载体的鉴定  37-40  3.3 讨论  40-41    3.3.1 构建亚克隆载体的选择  40    3.3.2 融合蛋白基因的设计思路  40-41  3.4 小结  41-42第四章 重组融合蛋白TB10.4-F1的表达与纯化  42-60  4.1 材料和方法  42-52    4.1.1 材料  42-48    4.1.2 方法  48-52  4.2 结果  52-56    4.2.1 重组目的蛋白的表达  52-53    4.2.2 重组目的蛋白的Western-blot鉴定  53-54    4.2.3 蛋白的纯度检测  54-56  4.3 讨论  56-58    4.3.1 构建克隆载体的选择  57    4.3.2 F1蛋白的表达  57-58    4.3.3 重组目的蛋白的表达形式  58    4.3.4 融合蛋白TB10.4-F1的纯化  58  4.4 小结  58-60第五章 重组融合蛋白TB10.4-F1的免疫原性检测  60-71  5.1 材料和方法  60-65    5.1.1 材料  60-62    5.1.2 方法  62-65  5.2 结果  65-69    5.2.1 标准曲线的绘制及其目的蛋白的定量  65-66    5.2.2 小鼠肺组织病理变化  66-67    5.2.3 小鼠特异性抗体的检测  67-69  5.3 讨论  69-70    5.3.1 免疫组小鼠血清特异性IgG变化  69    5.3.2 小鼠血清中特异性IgG1/IgG2a比值变化  69-70    5.3.3 小鼠肺部病理变化  70  5.4 小结  70-71第六章 重组融合蛋白TB10.4-F1的安全性检测  71-80  6.1 材料和方法  71-72    6.1.1 材料  71    6.1.2 方法  71-72  6.2 结果  72-77    6.2.1 攻毒后小鼠体重变化  72-73    6.2.2 攻毒后小鼠体征变化  73    6.2.3 攻毒后小鼠Th反应极化情况检测  73-74    6.2.4 攻毒后小鼠血清IgA变化  74    6.2.5 攻毒后小鼠呼吸道中sIgA检测  74-75    6.2.6 攻毒后小鼠肺部病理变化  75-77  6.3 讨论  77-78    6.3.1 攻毒后小鼠身体表征变化  77    6.3.2 攻毒后小鼠肺表面形态及其组织病理变化  77-78    6.3.3 攻毒后小鼠Th1/Th2免疫反应分析  78    6.3.4 攻毒后小鼠肺灌洗液中sIgA分析  78  6.4 小结  78-80第七章 全文总结  80-81第八章 展望  81-82致谢  82-83参考文献  83-86附录A  86-87  一、攻读硕士期间发表论文目录  86  二、攻读硕士期间发表专利目录  86  三、攻读硕士期间参加项目情况  86-87附录B 其他需要说明的内容  87

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中图分类: > 医药、卫生 > 儿科学 > 小儿内科学 > 小儿呼吸系及胸部疾病
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