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HCV准种变异特性及其免疫逃逸机制初步研究

作 者: 何立华
导 师: 夏雪山
学 校: 昆明理工大学
专 业: 微生物学
关键词: 丙型肝炎病毒 准种 变异 免疫逃逸 慢性感染者 病程转归者
分类号: R392.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
下 载: 9次
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内容摘要


丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)为单股正链RNA病毒,属于黄病毒科,肝炎病毒属,基因组全长约9.6kb。HCV在复制过程中,由于RNA依赖的RNA聚合酶缺乏校对功能,导致HCV高度变异。病毒在宿主体内存在的多种变异株(同源性>95%)称为准种。感染者体内存在的HCV准种反映在特定环境下以病毒复制、变异为基础的突变株竞争性选择的结果。准种的复杂情况与疾病进展、病程转归密切相关。病毒CTL抗原表位编码基因发生变异产生的HCV准种,是病毒逃避宿主免疫监控及药物治疗不反应的主要原因。本研究首先根据HCV病毒载量等临床指标,从50例候选者中筛选出16名HCV单独感染者,经5NCR区和NS5B区基因扩增及核酸序列分析,确定研究入选者感染HCV为4种基因型/亚型,分别为1b、3a、3b和6n,以1b(41.25%)和3b(36.75%)型为主。16名入选者均接受不同程度的药物治疗,经长期(1.5年)病程跟踪和临床指标检测发现,8例入选者继续维持慢性感染,另外8例病程转归,病毒RNA检测为阴性。进而建立了E2区和NS5A区准种检测方法-—多克隆测序分析法,以准种Neighbor-joining进化树、标准化熵值、平均遗传距离和dN/dS值等指标评价准种特性与变化情况。研究发现,慢性感染者和治疗病程转归者在入选初期,体内E2区准种平均遗传距离波动分别为0.0097~0.0625和0.0037~0.0269,熵值波动分别为0.9063~0.9786和0.5769~0.8849;NS5A区准种平均遗传距离波动分别为0.0050~0.0113和0.0022~0.0095,熵值波动分别在0.8847~0.9734和0.5187~0.8007。两个区段HCV准种的平均遗传距离和熵值,慢性感染者均大于治疗病程转归者,表明HCV准种异质性程度越低的患者,更易于产生治疗应答。对入选初期E2区和NS5A区准种dN/dS比值分析发现,所有慢性感染者和6例病程转归者准种dN/dS比值都小于1,其体内准种变化主要由遗传漂变引起。在病程转归者中,有2例患者dN/dS比值大于1,其准种变异是由达尔文进化压力造成的。进而,研究对入选者病程跟踪,多个时间点采集的样本,使用BEAST软件估算患者体内HCV准种的起源时间和进化速率,构建准种群体数量变化的BSP图,并对HCVE2区准种变化指标(多样性和复杂性)与临床指标(ALT值和AST值)相关性进行分析。发现8名慢性感染者随着病程进展,E2区和NS5A区准种存在渐变和彻变两种进化模式,这两个基因区段准种变异呈现出协同进化的特点,即在同一个病人体内E2区和NS5A区段进化模式相同。治疗病程转归者HCV准种进化速率(5.84×10-3 sub/site/month)明显高于持续感染者(0.61×10-3~1.31×10-3sub/site/month)。HCV E2区准种的多样性和复杂性与血清ALT、AST值之间无显著相关性(p>0.05)。最后,研究采用Elispot方法对一例慢性感染者(KM10)病程进展过程中,不同时间采集的PBMC中效应性CTL数量进行了测定。经HCV主要准种氨基酸序列分析发现,该慢性感染者在入选观察初期(T1期)病毒E2区CTL抗原表位(LLFTPGSKQNV)随着病程进展(T4期)1年内发生了较大变化(SFFTSGPKQNI),利用合成的T1期主要准种抗原多肽(NH2-SLLFTPGSKQNVQ-COOH),分别刺激T1和T4期采集的PBMC细胞,发现此抗原多肽的效应性CTL在观察初期(T1期)为307个,病程后期(T4期)只有21个,由于抗原表位编码基因变异,CTL明显不能免疫识别。本研究对经过治疗的HCV单独感染者进行随访研究,使用多克隆测序法分析HCV准种变异规律,并建立了Elispot方法分析HCV免疫逃逸,初步分析了CTL抗原表位变异的免疫逃逸能力及其对病程进展的影响,为丙型肝炎慢性化致病机制及疫苗研制等方面的研究提供直接依据。

全文目录


摘要  4-6ABSTRACT  6-9目录  9-12插图和附表清单  12-14缩略词  14-15第一章 绪论  15-32  1.1 丙型肝炎与丙型肝炎病毒  15-20    1.1.1 丙型肝炎的流行与危害  15    1.1.2 HCV的发现  15-16    1.1.3 HCV生物学特性  16-20  1.2  20-21    1.2.1 HCV的变异  20    1.2.2 HCV基因型和亚型  20-21  1.3 HCV准种  21-26    1.3.1 HCV准种的产生及其特性  22    1.3.2 HCV准种的研究方法  22-25    1.3.3 HCV准种特性的临床意义  25-26  1.4 HCV准种变化关键区域——E2区和NS5A区作用及研究现状  26-28    1.4.1 包膜蛋白和NS5A蛋白的结构  26    1.4.2 E2蛋白和NS5A蛋白的作用  26-27    1.4.3 E2区和NS5A区准种研究现状  27-28  1.5 HCV变异产生免疫逃逸  28-30    1.5.1 体液免疫  29    1.5.2 细胞免疫  29-30  1.6 本研究的目的意义  30-31  1.7 实验技术路线图  31-32第二章 入选病人病程特点与HCV基因型测定  32-47  2.1 引言  32-33  2.2 材料与方法  33-40    2.2.1 实验材料  33    2.2.2 主要试剂(试剂盒)及溶液配制  33-34    2.2.3 实验仪器设备  34    2.2.4 引物  34    2.2.5 实验方法及主要操作步骤  34-40  2.3 结果  40-43    2.3.1 研究样本特征  40-41    2.3.2 逆转录巢氏PCR扩增检测结果  41    2.3.3 基于NS5B区和5'NCR区基因分型结果  41-43  2.4 讨论  43-46    2.4.1 研究人群临床指标分析  43-45    2.4.2 研究人群基因型分布特点  45-46  2.5 小结  46-47第三章 丙型肝炎病毒准种研究  47-71  3.1 引言  47-48  3.2 材料和方法  48-54    3.2.1 实验材料  48    3.2.2 主要试剂(试剂盒)及溶液配制  48    3.2.3 实验仪器设备  48    3.2.4 引物设计  48-49    3.2.5 实验方法及主要操作步骤  49-54  3.3 结果  54-65    3.3.1 随访期间HCV患者分子及临床指标分析  54-55    3.3.2 琼脂糖凝胶电泳检测结果  55-56    3.3.3 随访初期HCV准种变异程度较小者治疗病程转归  56-58    3.3.4 慢性HCV患者E2和NS5A区准种协同进化  58-60    3.3.5 BEAST软件分析HCV准种  60-62    3.3.6 E2区准种参数与临床指标的相关性分析  62-65  3.4 讨论  65-70    3.4.1 慢性感染及病程转归患者体内HCV准种变化  65-67    3.4.2 慢性感染者体内HCV E2和NS5A区准种表现为协同进化  67-68    3.4.3 HCV准种进化动力学  68-69    3.4.4 HCV准种变化与临床指标之间没有相关性  69-70  3.5 小结  70-71第四章 HCV准种变异导致CTL免疫逃逸的初步研究  71-79  4.1 前言  71  4.2 材料和方法  71-75    4.2.1 实验材料  71-72    4.2.2 主要试剂(试剂盒)及溶液配制  72    4.2.3 实验仪器设备  72    4.2.4 实验方法及主要操作步骤  72-75  4.3 结果  75-76    4.3.1 CTL抗原表位变异  75    4.3.2 CTL抗原肽合成  75-76    4.3.3 Elispot结果分析  76  4.4 讨论  76-78    4.4.1 Elispot检测原理  76-77    4.4.2 CTL免疫逃逸导致慢性感染的机制  77-78  4.5 小结  78-79第五章 结论  79-81  5.1 研究人群的筛选及基因型确定  79  5.2 建立了多克隆测序法分析HCV E2和NS5A区准种变异  79  5.3 使用BEAST软件估算HCV准种动力学及其起源进化时间  79-80  5.4 初步建立Elispot方法分析HCV准种变异引起的CTL免疫逃逸  80-81致谢  81-82参考文献  82-90附录A 攻读硕士期间发表论文目录  90

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学 > 免疫生物学
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