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低毒力病毒CHV1-CN280对寄主毒性的影响及其p29基因在栗疫菌及稻瘟菌中的功能分析

作　者: 张林巧
导　师: 王克荣
学　校: 南京农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 栗疫菌 低毒力病毒 p29 基因功能
分类号: S436.64
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


粟疫病(Cryphonectria parasitica)是世界最著名的森林病害之一,曾造成美洲粟濒临灭绝。栗疫菌细胞中的低毒力病毒是一类没有衣壳的双链RNA病毒,可以引起寄主粟疫菌的菌落形态变化、分生孢子和色素的产量降低、雌性不育和漆酶产量与活性降低。更重要的是,低毒力病毒的侵染会导致栗疫菌毒力的下降,这一发现为栗疫病的生物防治提供了一种全新的思路。CHV1-CN280是来自我国的低毒力病毒,与其它低毒力病毒相比,具有较高的病毒传播能力,低毒力病毒在栗疫菌株之间传播的成功与否,决定了生物防治能否取得成功。很显然,应用传播能力更高的低毒力病毒,将会大大提高对栗疫病的生物防治效果。本文通过对具有较高的病毒传播能力的低毒力病毒CHV1-CN280与另两个已经进行了全基因组测序的低毒力病毒(CHV1-EP713、CHV1-Euro7)对不同菌株生物学性状影响的比较,评估CHV1-CN280的生防潜力和在田间定殖与扩散能力。与来自欧洲的其它两个低毒力病毒相比,CHV1-CN280对寄主的毒性较弱,除了显著降低栗疫菌的致病力外,对菌株的生长速率、分生孢子与色素产量等影响较小,具有良好的生防特性。对CHV1-CN280在田间的定殖能力的评估结果表明,低毒力病毒CHV1-CN280在田间接种后,能够成功定殖并自然扩散至其它营养体亲和群的野生栗疫菌菌株中。研究认为,与其它低毒力病毒相比,CHV1-CN280在中国具有更好的生防潜力。另外,本文通过外源DNA导入法对CHV1-CN280病毒的p29基因在栗疫菌和稻瘟菌中的功能进行了研究。实验克隆了CHV1-CN280病毒的p29基因,将其连接至不同的表达载体并分别导入栗疫菌及稻瘟菌的基因组。结果发现,该基因在栗疫菌中表达并引起寄主色素减少、孢子量下降、生长速率降低以及漆酶活性降低等低毒力特征的表型变化。p29基因在稻瘟菌中表达则引起寄主分生孢子量、漆酶活性、生长速率等生物学性状正向增长的表型改变。该基因在原寄主和非原寄主中表达的结果具有显著差异。该基因在原寄主中表达的结果能引起寄主部分表型发生类似低毒力性状的改变,而另一部分表型却表现出相反的结果,相比Nuss等人的研究结果,研究认为,CHV1-CN280与CHV1-EP713各自p29具有不完全一致的基因功能,其主要原因应归于两种病毒之间的p29的氨基酸序列具有较大差异。另外,p29在栗疫菌之外的寄主中表达,也不能引起该寄主发生类似栗疫菌中低毒力性状的改变。

全文目录


摘要  7-9ABSTRACT  9-11上篇 文献综述  11-32  1 栗疫菌的发生与防治  12-13    1.1 栗疫病的发生与危害  12    1.2 栗疫病的病原及发病情况  12-13  2 栗疫菌的防治  13-20    2.1 栗疫病抗病育种和化学防治  13-14    2.2 利用低毒力病毒进行栗疫菌的生物防治  14-20      2.2.1 低毒力病毒的发现  14-15      2.2.2 低毒力病毒的传递  15-17      2.2.3 营养体亲和性  17-18      2.2.4 低毒力病毒应用于生物防治  18-20  3 低毒力病毒基因组遗传结构研究  20-27    3.1 低毒力病毒的基因组的特点  20-23    3.2 低毒力病毒的基因组功能  23-27  参考文献  27-32下篇 研究内容  32-71  第一章 低毒力病毒CHV1-CN280对寄主毒性的影响  33-49    1 材料和方法  34-39      1.1 供试菌株  34-35      1.2 试验材料  35      1.3 各菌株生物学特性测定  35-36        1.3.1 各菌株生长表型及生长速率测定  35-36        1.3.2 各菌株产孢量测定  36        1.3.3 各菌株室内毒力测定  36      1.4 田间试验  36-37        1.4.1 接种  36        1.4.2 采样、分离和纯化  36-37      1.5 低毒力菌株的形态学鉴定  37      1.6 林中分离病毒的分子生物学鉴定  37-39        1.6.1 菌丝粉制备  37        1.6.2 dsRNA提取  37-38        1.6.3 RT-PCR与cDNA测序  38-39    2 结果和分析  39-44      2.1 菌株生长表型  39-40      2.2 各菌株生长速度测定  40-41      2.3 菌株分生孢子量测定  41      2.4 弱毒力菌株致病性测定  41-42      2.5 田间分离结果鉴定  42-44        2.5.1 营养体亲和性鉴定  42-43        2.5.2 分子生物学鉴定  43-44    3 讨论  44-46    参考文献  46-49  第二章 CHV1-CN280低毒力病毒中p29基因在栗疫菌及稻瘟菌中的功能研究  49-71    1 材料与方法  52-57      1.1 供试菌株及培养条件  52      1.2 低毒力菌株CHV1-CN280的dsRNA的提取和反转录  52      1.3 p29基因的克隆及序列分析  52-53        1.3.1 栗疫菌中表达载体的构建  52        1.3.2 稻瘟菌中表达载体的构建  52        1.3.3 不同CHV1病毒中p29序列分析  52-53      1.4 原生质体的制备和转化  53-54        1.4.1 栗疫菌原生质体的制备和转化  53        1.4.2 稻瘟菌原生质体的制备和转化  53-54      1.5 转化子的筛选和验证  54-55        1.5.1 DNA、RNA的提取和cDNA的合成  54        1.5.2 PCR法检测  54        1.5.3 RT-PCR方法验证  54        1.5.4 Southern blot验证  54-55      1.6 栗疫菌中突变体表型分析  55-56        1.6.1 菌落形态观察及生长速率测定  55        1.6.2 突变体分生孢子产量测定  55        1.6.3 突变体漆酶活性测定  55        1.6.4 突变体致病力测定  55-56      1.7 稻瘟菌中突变体表型分析  56-57        1.7.1 菌落形态观察及生长速率测定  56        1.7.2 突变体分生孢子产量测定  56        1.7.3 致病力情况调查  56        1.7.4 突变体漆酶活性测定  56-57        1.7.5 突变体对胞外过氧化物酶的影响  57    2 结果分析  57-65      2.1 p29基因的克隆转化子的筛选和序列分析  57-60        2.1.1 PCR法检测  57-58        2.1.2 RT-PCR方法验证  58-59        2.1.3 Southern blot方法验证  59        2.1.4 p29编码蛋白的序列比对结果分析  59-60      2.2 突变体菌落形态观察及生长速率分析  60-62      2.3 突变体分生孢子产量  62      2.4 突变体对漆酶的影响  62-64        2.4.1 栗疫菌中转化子漆酶活性检测及相关基因表达量分析  62-63        2.4.2 稻瘟菌中转化子漆酶活性检测及相关基因表达量分析  63-64      2.5 突变体对胞外过氧化物酶的影响  64-65        2.5.1 胞外过氧化物酶活性检测及含量测定  64        2.5.2 胞外过氧化物酶相关基因表达量分析  64-65    3 讨论  65-68    参考文献  68-71附录1  71-77附录2  77-79攻读硕士学位期间发表的研究论文  79-81致谢  81

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 园艺作物病虫害及其防治 > 果树病虫害 > 坚果类病虫害
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