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重组人核心蛋白聚糖对白血病K562细胞体外影响的实验研究

作　者: 景刚
导　师: 王桂琴
学　校: 山西医科大学
专　业: 免疫学
关键词: 重组人核心蛋白聚糖 K562细胞 凋亡 细胞周期 BCL-XL Mcl-1 Bax 多柔比星 TGF-β1mRNA
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的：观察重组人核心蛋白聚糖(rhDCN)对白血病K562细胞生长抑制、凋亡的影响,并探讨可能的作用机制。方法：1.将已构建好的pcDNA3.1(+)-DCN真核表达载体经EcoRI、NotI双酶切、测序鉴定。2.鉴定正确的重组质粒大量纯化扩增后,通过LipofectamineTM2000脂质体介导转染对数生长期的白血病K562细胞,提取转染后48h细胞的总RNA,并进行RT-PCR鉴定。3.试验分为0.9% NaCl溶液组、pcDNA3.1(+)/K562组、pcDNA3.1(+)-DCN/K562组和脂质体组。4.经瑞特染色观察转染后细胞形态的改变,MTT法检测细胞增殖活性,碘化丙啶(PI)染色,流式细胞术分析细胞周期及凋亡。5.Western blot检测细胞凋亡相关蛋白BCL-XL、Mcl-l及Bax的表达。结果：1.重组质粒双酶切后,所得基因片断与预期基因片断大小相符；测序结果与Genebank中的DCN基因序列完全相符,无突变。2.通过脂质体转染法将pcDNA3.1(+)-DCN重组质粒转入K562细胞后,RT-PCR结果证实转染成功。3.pcDNA3.1 (+)-DCN/K562组瑞特染色呈现典型的凋亡形态学改变,其他各组无明显凋亡形态学改变。4.MTT结果显示,pcDNA3.1 (+)-DCN/K562组细胞增殖抑制率(转染24h为16±1.08%,转染48h为14±1.01%,转染72h为20±1.19%)明显高于对应时间点其他组增殖抑制率,差别有统计学意义(P<0.05)；FCM检测结果显示,pcDNA3.1 (+)-DCN/K562组凋亡率(20.15±1.31%)、细胞的G0/G1期细胞百分率(51.15±0.57%)与其他各组结果比较增加明显,差别有统计学意义(P<0.05)。5.Western blot结果显示pcDNA3.1 (+)-DCN/K562组与其他各组比较BCL-XL、Mcl-1蛋白表达减低,Bax蛋白表达升高。结论：rhDCN重组质粒可有效抑制K562细胞增殖,并诱导其凋亡。rhDCN对细胞周期及凋亡相关蛋白BCL-XL、Mcl-1、Bax的影响可能是其发挥作用的机制,为白血病生物治疗提供了新的实验依据。目的：研究重组人核心蛋白聚糖(rhDCN)联合多柔比星(ADM)对白血病K562细胞生长的影响,并分析其可能机制。方法：用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液体外培养K562细胞,经脂质体介导转染对数生长期的K562细胞,试验分为0.9% NaCl溶液组、pcDNA3.1(+)-DCN/K562组、ADM/K562组、pcDNA3.1(+)-DCN加ADM/K562组。瑞特染色观察细胞形态学改变；采用MTT法检测细胞增殖活性；流式细胞术(FCM) Annexinv/PI双染色,分析细胞凋亡；采用RT-PCR法分析各处理组K562细胞TGF-β1mRNA水平表达的变化。结果：pcDNA3.1(+)-DCN加ADM/K562组细胞比单独DCN和ADM组细胞,染色呈现更显著的凋亡形态学改变；MTT结果显示联合组细胞增殖抑制率(61±1.32%)明显高于单独干预组(DCN组20±1.9%；ADM组47±1.04%)(P<0.05),FCM检测结果显示联合组细胞凋亡率(61.30±0.9%)与单独干预组(DCN组28.25±1.3%；ADM组31.85±1.5%)比较增加明显(P<0.05),RT-PCR结果显示联合组细胞TGF-β1 mRNA的转录减少。结论：rhDCN可以明显增强ADM对K562细胞的杀伤作用,提高肿瘤细胞的凋亡率。对TGF-β1 mRNA转录的影响可能是发挥协同效应的原因,其具体机制有待进一步研究。

全文目录


中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
缩略语表  9-11
前言  11-13
第一部分 重组人核心蛋白聚糖对K562细胞增殖及凋亡作用的实验研究  13-36
  材料与方法  13-25
  结果  25-32
  讨论  32-33
  小结  33-34
  参考文献  34-36
第二部分 重组人核心蛋白聚糖基因增强多柔比星对K562细胞作用的实验研究  36-45
  材料与方法  36-39
  结果  39-42
  讨论  42-43
  小结  43-44
  参考文献  44-45
综述  45-52
  正文  45-50
  参考文献  50-52
个人简介  52-53
致谢  53

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病
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