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黄曲霉毒素B₁和脱氧雪腐镰刀菌烯醇诱导锦鲤原代肝细胞凋亡机制的初步研究

作　者: 吕伟
导　师: 张海彬
学　校: 南京农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 黄曲霉毒素B1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇锦鲤原代肝细胞细胞凋亡
分类号: S856.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

霉菌毒素(Mycotoxin)是由霉菌产生的有毒次级代谢产物,各种饲料原料及成品都可能发生霉变而遭受霉菌毒素的污染。黄曲霉毒素B1(AFB1)是迄今为止人类所知的毒性最强的物质之一,可能对动物机体造成严重的伤害。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)又名呕吐毒素,是一种全球性的谷物污染物,DON的毒性较弱,但污染范围和含量远超过其他毒素。根据对中国饲料及原料中霉菌毒素的调查发现,DON的阳性检出率为93.0%,平均值为1140mg·kg-1,检出率远高于其他霉菌毒素。AFB1的毒性最强,DON的污染范围最广,但目前的研究主要集中在一种毒素对动物机体的影响,多种霉菌毒素间的相互作用机制报道较少,临床上两种毒素共同作用于动物机体的现象广泛存在,两者之间对动物机体影响的相互关系显得十分重要。且AFB1和DON对肝脏都具有明显的毒性作用,本试验选用锦鲤原代肝细胞,研究AFB1和DON单独和联合作用下,对锦鲤肝细胞形态学变化、凋亡率、线粒体跨膜电位的变化及凋亡通路相关基因表达的影响,初步探讨AFB1和DON诱导锦鲤肝细胞的作用机制,为深入研究AFB1和DON的毒性机理奠定基础。试验一：本试验将处于对数生长期的锦鲤原代肝细胞分别用10和20 ng·mL-1 AFB1,125.250、500、1000和2000 ng·mL-1DON以及10+125、10+250、10+500、20+125、20+250和20+500 ng·mL-1的AFB1+DON(培养基中的毒素终浓度)进行处理。12h后,用倒置显微镜观察细胞的形态学变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果显示：随着毒素浓度的增加,对细胞密度及生长状态的影响增强；随着DON浓度的增加,凋亡率逐渐增加；联合毒素组,在AFB1存在的条件下,随着DON浓度的增加,锦鲤肝细胞凋亡率逐渐增加。试验二：本试验将处于对数生长期的锦鲤原代肝细胞分别用10和20 ng·mL-1 AFB1,125.250、500、1000和2000 ng·mL-1DON以及10+125、10+250、10+500、20+125、20+250和20+500 ng·mL-1的AFB1+DON(培养基中的毒素终浓度)进行处理,JC-1染色,用流式细胞仪检测线粒体跨膜电位。结果显示：与对照组相比AFB1试验组线粒体跨膜电位变化差异不显著,随着DON浓度(0-500 ng·mL-1)的增加线粒体跨膜电位逐渐降低,AFB1+DON试验组,在AFB1存在的条件下,随着DON浓度的增加,线粒体跨膜电位变化逐渐降低,且与DON单独试验组相比线粒体跨膜电位变化下降显著。试验三：本试验将处于对数生长期的锦鲤原代肝细胞分别用125、250、500和1000ng·mL-1 DON以及10+125、10+250、10+500、20+125和20+250 ng·mL-1的AFB1+DON(培养基中的毒素终浓度)进行处理,作用12h后,提取总RNA,逆转录后进行荧光定量PCR。结果显示：随着DON浓度的增加,Bcl-2/Bax数值逐渐降低,在500 ngmL-1时达到最低值,1000 ng·mL-1时略有上升；AFB1+DON试验组,在AFB1存在条件下,随着DON浓度的增加,Bcl-2/Bax数值逐渐降低,在10+500 ng·mL-1的AFB1+DON时达到最低值,且与DON单独作用相比Bcl-2/Bax下降显著。

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摘要 6-8ABSTRACT 8-10符号及缩略语 10-12第一篇文献综述 12-38 第一章黄曲霉毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒理学研究进展 12-24 1 黄曲霉毒素 12-15 1.1 黄曲霉毒素的理化特性 12-13 1.2 黄曲霉毒素的污染情况 13 1.3 黄曲霉毒素的毒性 13-15 2 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 15-18 2.1 DON的理化特性 15-16 2.2 污染情况 16 2.3 毒性作用 16-18 3 AFB1和DON的相互作用 18-19 参考文献 19-24 第二章细胞凋亡的研究进展 24-38 1 细胞凋亡的特性 24-25 2 细胞凋亡的主要调控基因 25-27 2.1 Bcl-2基因家族 25-26 2.2 抑癌基因p53 26-27 2.3 C-myc与细胞凋亡 27 2.4 caspase与细胞凋亡 27 3 细胞凋亡途径与信号传导 27-29 3.1 线粒体途径 27-28 3.2 内质网途径 28-29 3.3 死亡受体途径 29 4 细胞凋亡的检测 29-30 4.1 形态学观察 29 4.2 细胞凋亡的流式细胞术分析 29-30 4.3 琼脂糖凝胶电泳法 30 4.4 线粒体跨膜电位(MMP)变化的检测 30 4.5 凋亡相关基因或蛋白的分析检测细胞凋亡 30 5 AFB_1和DON与细胞凋亡 30-33 5.1 AFB_1与细胞凋亡 30-31 5.2 DON与细胞凋亡 31-32 5.3 AFB_1与DON联合与细胞凋亡 32-33 参考文献 33-38第二篇实验研究 38-70 第三章 AFB_1和DON诱导锦鲤原代肝细胞凋亡形态学变化及凋亡率的检测 38-48 1 材料与方法 38-40 1.1 材料 38-39 1.2 方法 39-40 2 结果 40-45 2.1 细胞形态的影响 40-44 2.2 细胞凋亡率检测 44-45 3 小结 45-46 4 讨论 46-47 参考文献 47-48 第四章 AFB_1和DON诱导锦鲤肝细胞凋亡线粒体跨膜电位的变化 48-58 1 材料与方法 48-50 1.1 材料 48-49 1.2 方法 49-50 2 结果 50-53 2.1 AFB_1对锦鲤肝细胞膜电位的影响 50-51 2.2 DON对锦鲤肝细胞膜电位的影响 51 2.3 AFB_1+DON对锦鲤肝细胞膜电位的影响 51-53 3 小结 53 4 讨论 53-55 参考文献 55-58 第五章 AFB_1和DON诱导锦鲤肝细胞凋亡对凋亡调控基因Bcl-2家族的影响 58-70 1 材料和方法 58-63 1.1 材料 58-59 1.2 方法 59-63 2 结果 63-67 2.1 DON对凋亡调控基因的影响 63-65 2.2 AFB_1+DON对凋亡调控基因的影响 65-67 3 小结 67 4 讨论 67-69 参考文献 69-70全文总结 70-72附录 72-74致谢 74

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