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沉默BMPR-IB基因对猪卵巢颗粒细胞凋亡及BMP通路相关基因表达的影响
作 者: 李新秀
导 师: 徐银学
学 校: 南京农业大学
专 业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 猪卵泡颗粒细胞 BMPR-IB RNAi 细胞凋亡
分类号: S828
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
BMPR-IB基因属于BMP家族的Ⅰ型受体,存在于许多细胞类型中,主要调节细胞生长和分化。在绵羊中,BMPR-IB基因中的碱基突变导致了氨基酸的改变,使得BMPR-IB基因部分失活,改变了BMP信号通路的传递机制,导致卵巢颗粒细胞对配体的抑制不再敏感,进而提高了绵羊的排卵率和繁殖力。近来发现,BMPR-IB基因的缺失,使小鼠卵巢颗粒细胞减少且聚集在一起,引起小鼠发情周期不规律和假孕反应。本研究以猪卵巢颗粒细胞为试验材料,利用流式细胞术、real time RT-PCR等方法检测沉默BMPR-IB基因对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响;用RNAi技术阻抑BMPR-IB基因表达,在此基础上,添加FSH,利用流式细胞术、real time RT-PCR等方法检测沉默BMPR-IB基因对FSH诱导的猪卵巢颗粒细胞的影响;用BMP配体(BMP6)激活BMP信号通路,用real time RT-PCR方法检测通路中受体及Smads的表达量。1 BMPR-IB-siRNA转染猪卵巢颗粒细胞及其效率检测根据猪BMPR-IB基因序列合成小分子RNA,利用脂质体转染猪卵巢颗粒细胞以及流式细胞仪检测转染效率,在BMPR-IB-siRNA转染浓度为100nmoL时,转染效率为63.22%;利用荧光定量PCR检测BMPR-IB mRNA表达水平,在作用36h时,BMPR-IB-siRNA抑制效果最好,试验组较空白组下降65%。利用流式细胞仪检测干扰后颗粒细胞凋亡率。结果显示,siRNA试验组凋亡率(16.86%)显著高于对照组(10.55%),且相应地抗凋亡基因Bcl-2表达量显著下降,表明沉默BMPR-IB可促进猪卵巢颗粒细胞的凋亡。2沉默BMPR-IB对FSH诱导猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响为了沉默BMPR-IB对FSH诱导猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响,采用RNAi技术沉默BMPR-IB基因然后添加FSH。利用流式细胞仪以及real time RT-PCR检测细胞的凋亡率和凋亡基因的表达量,以及类固醇相关合成酶的表达量。结果表明:FSH能抑制细胞凋亡,沉默BMPR-IB基因后再添加FSH使细胞凋亡率减弱但是效果不明显,与之对应的原凋亡基因Bax和抗凋亡基因Bcl-2的变化不明显;FSH能使FSHR的表达量增加,但是BMPR-IB表达的消减抑制了FSH增加自身受体的表达量;另外,发现添加FSH能使CYP19a1和CYP11a1的表达量增加,但BMPR-IB表达的消减抑制了FSH引起的CYP19a1和CYP11a1的表达的增加。3沉默BMPR-IB对BMP6诱导的BMP信号通路中相关基因表达的影响为了研究BMPR-IB-siRNA转染猪卵巢颗粒细胞对BMP信号通路的影响,采用RNAi技术沉默BMPR-IB基因,阻断信号传导,另一方面,添加BMP6来激活通路,利用real time RT-PCR分别检测阻抑或激活后受体和Smads的表达量。结果表明,沉默BMPR-IB能使受体BMPR-IA和BMPR-II的表达量增加,Smad1、Smad5和Smad8基因的mRNA表达量下降,Smad7基因的mRNA表达量显著增加。而添加配体BMP6使受体BMPRIA和BMPRII的表达量下降,Smad1、Smad5和Smad8基因的mRNA表达量增加,Smad7基因的mRNA表达量下降。BMPR-IB-siRNA阻抑通路后用BMP6激活,与BMP6组相比,受体基因BMPRIA和BMPRII以及Smadl和Smad5的表达都显著变化,但Smad8的表达量明显下降,而与抑制组相比,差异不显著;且无论添加BMP6与否,Smad7在沉默BMPR-IB后表达量都增加。
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全文目录
中文摘要 7-9ABSTRACT 9-11缩略语 11-12文献综述 12-28 1 骨形成蛋白(BMP)的研究进展 12-17 1.1 BMPs的分类 12-13 1.2 BMPs的生物学功能 13-15 1.3 BMP受体的分类 15-16 1.4 BMPs受体的信号传导 16-17 2 BMPR-IB的研究进展 17-20 2.1 BMPR-IB基因的发现 17-18 2.2 BMPR-IB突变的分子的结构 18 2.3 BMPR-IB基因对动物繁殖性能的影响 18-20 2.4 BMPR-IB的作用机制 20 3 试验的目的与意义 20-22 参考文献 22-28试验研究 28-58 试验一 BMPR-IB-siRNA转染猪卵巢颗粒细胞效率的检测及对细胞凋亡的影响 28-42 1 材料与方法 28-35 1.1 材料 28-29 1.2 方法 29-35 2 结果与分析 35-37 2.1 流式细胞仪检测FAM-siRNA转染颗粒细胞的效率 35 2.2 siRNA转染颗粒细胞对BMPR-IB mRNA的表达的影响 35-36 2.3 沉默BMPR-IB对颗粒细胞凋亡的影响 36 2.4 沉默BMPR-IB对颗粒细胞凋亡相关基因的表达的影响 36-37 3 讨论 37-38 4 小结 38-40 参考文献 40-42 试验二 BMPR-IB-siRNA对FSH诱导的猪卵巢颗粒细胞凋亡影响 42-50 1 材料与方法 42-44 1.1 材料 42 1.2 方法 42-44 2 结果与分析 44-46 2.1 siRNA转染颗粒细胞对FSH诱导的细胞凋亡的影响 44 2.2 siRNA转染颗粒细胞对FSH诱导的细胞凋亡相关基因的表达的影响 44-45 2.3 siRNA转染颗粒细胞对FSH诱导的FSHR的影响 45-46 2.4 SiRNA转染颗粒细胞对FSH诱导的类固醇合成相关酶表达的影响 46 3 讨论 46-47 4 小结 47-48 参考文献 48-50 试验三 沉默BMPR-IB对BMP6诱导的BMP信号通路中相关基因表达的影响 50-58 1 材料与方法 50-52 1.1 材料 50 1.2 方法 50-52 2 结果与分析 52-54 2.1 BMPR-IB-siRNA转染颗粒细胞对BMP6诱导的BMP信号通路中相关基因表达的影响 52-54 3 讨论 54-55 4 小结 55-56 参考文献 56-58全文结论 58-60附录 60-62致谢 62
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 猪
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