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马铃薯Rubisco活化酶启动子功能分析

作　者: 曲东
导　师: 张永强
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物安全
关键词: 启动子光诱导组织特异性表达转基因烟草
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

Rubisco活化酶(RCA)是核基因编码的水溶性叶绿体蛋白,具有活化Rubisco和ATP水解酶活性。研究表明,在玉米、小麦、菠菜、豌豆、烟草和拟南芥中,RCA基因的表达均表现为光诱导性和组织特异性。本研究以已克隆的马铃薯(Solanaum tuberosum . L)RCA基因5′上游调控序列(StRCAp731)为研究对象,构建系列缺失植物表达载体,经农杆菌介导的遗传转化,获得转基因烟草株系。利用Southern blot、Northern blot分子检测、GUS染色、gus基因表达定量分析等技术,开展其启动功能与表达调控验证分析。研究结果如下:1. PLantCARE序列分析表明,已克隆的StRCA基因启动子含有多个CAAT框和调控元件,包括与光反应相关的ATCT,Box I,I-box,GT1-motif,与乙烯诱导相关的ERE等。2.根据StRCA基因5′上游序列设计系列缺失实验,分别构建缺失系列植物表达载体StRCAp498、StRCAp249、StRCAp175、StRCAp149、StRCAp98,经农杆菌介导的遗传转化,获得转基因烟草株系。3. GUS组织化学染色结果表明:以35S作为启动子的转基因烟草,gus基因整株表达;而含有StRCA启动子的转基因烟草,gus只在叶片和茎表达;转缺失启动片段StRCAp498和StRCAp249的烟草中,gus基因只在叶片中表达。4. GUS定量分析比较结果显示:本研究克隆的StRCA启动子活性为CaMV35S启动子的60%,而缺失系列启动子StRCAp498和StRCAp249活性较低,分别为CaMV35S启动子活性的22%和12%。5. Northern杂交结果表明:不同光照时间处理StRCAp731转基因烟草,gus基因表达随光照时间的增加而增强,黑暗培养下的植株叶片无表达,光照处理24hr时达到最大值,进一步证实了该启动子具有光诱导性。各启动子缺失片断的功能分析与StRCAp731结果相同,缺失片段-249bp仍具有启动功能和光诱导特性。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-12
第一章文献综述  12-31
  1.1 启动子结构特征及分类  12-18
    1.1.1 植物启动子结构特征  12-13
      1.1.1.1 转录起始位点  12
      1.1.1.2 核心启动子  12-13
      1.1.1.3 一般性上游元件  13
      1.1.1.4 专一性上游元件  13
    1.1.2 植物启动子调控  13-14
    1.1.3 启动子研究的一般方法  14-16
      1.1.3.1 生物信息学方法  14
      1.1.3.2 5′端缺失法  14-15
      1.1.3.3 离体瞬时表达分析  15
      1.1.3.4 稳定表达分析  15
      1.1.3.5 内部缺失突变法  15
      1.1.3.6 衔接物扫描突变法  15
      1.1.3.7 定点突变法  15-16
    1.1.4 植物启动子的分类  16-18
      1.1.4.1 组成型启动子  16
      1.1.4.2 特异性启动子  16-17
      1.1.4.3 诱导型启动子  17-18
  1.2 诱导型启动子研究  18-30
    1.2.1 光照诱导型启动子  18-20
    1.2.2 非生物逆境诱导型启动子  20-23
      1.2.2.1 温度诱导型启动子  20-21
      1.2.2.2 干旱诱导型启动子  21-22
      1.2.2.3 盐诱导型启动子  22-23
    1.2.3 化学诱导型启动子  23-26
      1.2.3.1 植物激素诱导型启动子  23-25
      1.2.3.2 化学物质诱导型启动子  25-26
    1.2.4 创伤诱导型启动子  26
    1.2.5 病原菌诱导型启动子  26-27
    1.2.6 重金属离子诱导型启动子  27-28
    1.2.7 诱导型启动子顺式作用原件  28-30
  1.3 本研究的目的、意义及技术路线  30-31
第二章材料与方法  31-46
  2.1 材料  31-32
  2.2 方法  32-46
    2.2.1 提取质粒DNA  32-33
    2.2.2 感受态细胞制备  33-34
      2.2.2.1 制备大肠杆菌感受态细胞  33
      2.2.2.2 根癌农杆菌LBA4404 感受态的制备  33-34
    2.2.3 大肠杆菌及农杆菌的转化  34
      2.2.3.1 大肠杆菌的热击转化  34
      2.2.3.2 重组质粒DNA 冻融法转入农杆菌LBA4404  34
    2.2.4 启动子5′系列缺失植物表达载体的构建  34-37
      2.2.4.1 PCR 扩增获得StRCAp 基因5′末端系列缺失序列  34-35
      2.2.4.2 目的片段的回收  35-36
      2.2.4.3 植物表达载体的构建  36-37
    2.2.5 农杆菌介导的烟草遗传转化  37
    2.2.6 GUS 的组织化学染色  37-38
    2.2.7 gus 基因表达的定量分析  38-40
      2.2.7.1 提取新鲜烟草叶片GUS 蛋白  38
      2.2.7.2 测定GUS 蛋白提取液中蛋白含量（Bradford 法）  38-39
      2.2.7.3 GUS 酶活的反应  39
      2.2.7.4 荧光定量  39-40
      2.2.7.5 酶活力计算方法  40
      2.2.7.6 酶活力计算采用 EXCEL 进行数据处理和 SAS8.1 进行统计分析  40
    2.2.8 烟草基因组DNA 提取  40
    2.2.9 Southern blot  40-43
    2.2.10 烟草总RNA 提取  43
    2.2.11 光照梯度处理试验  43
    2.2.12 Northern Blot  43-46
第三章结果与分析  46-54
  3.1 启动子序列分析  46
  3.2 植物表达载体的构建  46-49
  3.3 农杆菌介导法转化烟草  49
  3.4 转基因烟草植株的PCR 鉴定  49-50
  3.5 转基因烟草 Southern Blot 检测  50-51
  3.6 GUS 组织化学染色检测转基因烟草幼苗组织特异性  51-52
  3.7 gus 基因表达的定量分析  52
  3.8 转 StRCAp 烟草植株光诱导性的 Northern Blot 检测  52-53
  3.9 5’系列缺失启动子光诱导性的 Northern Blot 检测  53-54
第四章结论及讨论  54-56
  4.1 结论  54
  4.2 讨论  54-56
参考文献  56-66
致谢  66-67
作者简历  67

马铃薯Rubisco活化酶启动子功能分析

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