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microR-21反义寡核苷酸对人大肠癌HT-29细胞生长抑制作用及化放疗敏感性的影响

作　者: 付建春
导　师: 熊建萍
学　校:
专　业: 肿瘤学
关键词: 慢病毒载体 miR-21ASO HT-29肠癌细胞 增殖 凋亡 侵袭 放化疗敏感性 新靶点
分类号: R735.34
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：观察慢病毒介导miR-21反义寡核苷酸下调大肠癌HT-29细胞内miR-21表达对大肠癌细胞生物学行为及化放疗敏感性的影响。探讨miR-21成为大肠癌靶向治疗的新靶点的可能性。方法：构建含miR-21反义寡核苷酸的慢病毒载体，通过慢病毒感染将miR-21ASO片段导入大肠癌HT-29细胞内下调miR-21表达，将转染miR-21ASO组作为实验组，另设正常HT-29细胞未转染组（Control组）、转染空载慢病毒组（HT-29/NC组）、转染U6snRNA组(HT-29/U6组)为对照组，用探针法PCR检测各组HT-29细胞内miR-21表达差异，验证经转染慢病毒载体后，实验组miR-21表达下调，再筛选出稳定转染细胞株进行后续各实验以研究下调HT-29细胞内miR-21表达后其生物学行为的变化以及对放化疗敏感性的影响。即通过细胞直接计数法检测各组细胞增殖情况，应用流式细胞术检测各组细胞细胞周期变化及细胞凋亡率是否有差异，通过细胞克隆形成实验收集各组细胞克隆形成率来分析细胞克隆形成情况，Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力，MTT法检测不同梯度药物浓度的肿瘤抑制率，以及经总量10GyX线照射后各组肿瘤细胞的生长抑制率。结果：1、转染miR-21ASO的实验组较正常HT-29细胞组miR-21表达明显下降，具有显著差异（P值＜0.01）；转染空载慢病毒组及U6snRNA对照组与正常组miR-21表达无明显差异。2、通过细胞直接计数法连续7天分别计数各组细胞数目，绘制细胞生长曲线，HT-29/ASO组细胞增殖速率相较于其他各对照组细胞明显更低，（P值＜0.01），而Control组、NC组、U6组各组间无显著差异。3、流式细胞仪检测结果显示转染miR-21ASO后细胞早期凋亡率较对照组明显增加，G0/G1期所占细胞总数百分比上升，而S期细胞百分比下降。4、细胞克隆形成实验显示HT-29/ASO组细胞克隆形成率明显低于HT-29组、HT-29/NC组及HT-29/U6组（P值＜0.01），而HT-29组、HT-29/NC组及HT-29/U6组之间细胞克隆形成率无显著差异。5、细胞侵袭实验显示转染miR-21ASO的实验组细胞侵袭能力明显低于对照组，下调miR-21表达的HT-29/ASO组穿过Matrigel膜的细胞数最少，与其他各组相比差异有统计学意义（P值＜0.01），HT-29/NC组及HT-29/U6组与未转染慢病毒Control组无明显差异（P值＞0.05）。6、MTT法检测下调miR-21后HT-29细胞对5-FU药物敏感性实验显示，在不同5-FU药物浓度下，HT-29/ASO转染组细胞的生长抑制率较各对照组细胞生长抑制率显著升高，差异具有统计学意义（P值＜0.01），HT-29/ASO组增敏倍数为2.35倍。7、MTT法检测下调miR-21后HT-29细胞对放疗敏感性实验，结果显示，总量10GyX线照射后HT-29/ASO组肿瘤细胞抑制率明显高于HT-29、HT-29/NC、HT-29/U6组，而各对照组间无明显差异。结论：慢病毒介导miR-21ASO感染HT-29细胞后，细胞的增殖、侵袭、克隆能力减弱，凋亡增加，对化放疗敏感性增强。miR-21可能在大肠癌的生长、侵袭、转移及化放疗敏感性中均发挥着抑制癌细胞发展的作用，有可能成为大肠癌治疗的新靶点。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-9
中英文缩略词表  9-10
第1章 引言  10-13
第2章 材料与方法  13-27
  2.1 实验材料  13
    2.1.1 慢病毒载体  13
    2.1.2 HT-29 细胞  13
  2.2 主要仪器和试剂  13-15
    2.2.1 主要仪器  13-14
    2.2.2 主要试剂  14-15
  2.3 实验方法  15-26
    2.3.1 慢病毒载体的合成  15-16
    2.3.2 细胞复苏、传代、冻存  16-17
    2.3.3 慢病毒转染  17-18
    2.3.4 RT-PCR 检测各组细胞间 miR-21 表达  18-22
    2.3.5 细胞计数法检测细胞增殖  22-23
    2.3.6 细胞周期及细胞凋亡分析  23-24
    2.3.7 细胞克隆形成试验  24
    2.3.8 细胞体外侵袭分析  24-25
    2.3.9 MTT 法检测下调 miR-21 对大肠癌细胞 5-FU 敏感性的影响  25
    2.3.10 MTT 法检测下调 miR-21 对大肠癌细胞放疗敏感性的影响  25-26
  2.4 统计学分析  26-27
第3章 结果  27-37
  3.1 荧光显微镜下观察各组细胞转染情况  27-28
  3.2 RT-PCR 检测各组细胞 miR-21 表达差异  28-29
  3.3 细胞计数法计数分析各组细胞增殖差异  29-30
  3.4 流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡  30-32
    3.4.1 PI 单染法检测细胞周期结果  30-31
    3.4.2 Annexin V-PE 检测各组细胞凋亡率  31-32
  3.5 细胞克隆形成实验  32-34
  3.6 Transwell 侵袭实验检测下调 miR-21 表达后细胞的侵袭力变化  34
  3.7 MTT 法检测下调 miR-21 后 HT-29 细胞对 5-FU 药物敏感性的影响  34-36
  3.8 MTT 法检测下调 miR-21 后 HT-29 细胞对放疗敏感性的影响  36-37
第4章 讨论  37-41
第5章 结论及展望  41-43
  5.1 结论  41
  5.2 展望  41-43
致谢  43-44
参考文献  44-47
攻读学位期间的研究成果  47-48
综述  48-56
  参考文献  54-56

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肠肿瘤 > 大肠肿瘤
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