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心肌梗死基因表达检测及心肌细胞分离平台的搭建

作　者: 曹密
导　师: 杨勇骥
学　校: 第二军医大学
专　业: 生物物理学
关键词: 基因表达心肌梗死心肌细胞分离 Presenilin基因膜片钳激光扫描共焦显微镜超微结构 L-型钙电流 Tween-80
分类号: R542.22
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：心肌梗死诱发心力衰竭,严重时可导致死亡,本实验研究了急性心肌梗死相关基因的表达,揭示了一些重要分子在心梗过程中的作用机制；分析了Tween-80对心肌细胞ICa·L的影响；探讨PSEN1对小鼠心脑血管发育的影响,对临床研究和治疗具有重要的指导意义。方法：1、大鼠心肌梗死基因的表达(1)采用冠状动脉左前降支结扎法制备急性心肌梗死模型,分别取结扎后0h、2h、4h、12h、24h大鼠心肌组织；(2)分离心肌梗死模型组和假手术组大鼠心肌细胞,经Fluo-5N/AM染色后,利用激光扫描共聚焦显微镜检测心肌细胞肌浆网钙容量；(3)采用常规透射电镜技术制备和观察心肌梗死组和假手术组大鼠心肌超微结构；(4)按照常规方法抽提RNA,进行实时荧光定量PCR检测,以双标准曲线方法定量分析不同时间点心肌组织的基因表达。2、Tween-80对心肌细胞L-型钙电流的影响采用酶解法分离获得大鼠心肌细胞,在膜片钳全细胞模式下记录心肌细胞的ICa.L,检测0.05%、0.1%、0.2%Tween-80对心肌细胞ICa·L的影响。对照组加入电极外液作为参照,分别取加药前20s和加药后150s数据做统计分析。3、PSEN1基因对心脏发育的影响以及小鼠心肌细胞分离平台的搭建(1)获得不同基因型的小鼠胚胎,光镜观察研究PSEN1对整胚发育的影响；(2)制作心脏石蜡切片标本,组织学分析PSEN1对心脏发育的影响；(3)通过PSEN1的loxp小鼠与Myh6-cre/Esr1小鼠杂交,得到PSEN1loxP、Myh6-cre/Esrl双阳性小鼠。成年后给小鼠注射Tamoxifen,将PSEN1从心肌系统中特异性敲除,建立PSEN1心脏特异基因敲除小鼠品系；(4)根据小鼠心肌细胞分离的要求,自研搭建了一套小鼠心肌细胞分离系统,成功获得单个小鼠心肌细胞。结果：1、心肌梗死后,心肌基因表达改变的同时超微结构也发生了改变,肌丝溶解,线粒体异常。TNFα和d IL6在心肌缺血过程中的有着相同的表达趋势,它们在冠脉结扎2h后表达上调,在12h表达达到峰值,24h后回到基础水平。说明随着缺血时间的增加,心肌出现了炎症反应,24h后炎症逐渐消失。心肌新陈代谢转录因子C-Myc在急性心肌梗死早期迅速上调,并在整个心肌梗死过程中都维持在高表达水平,表明心肌缺血后,心肌细胞为了适应生理变化,新陈代谢异常活跃。心房钠尿肽(ANP)随时间的推移表达量升高,在24h时到达峰值,表明心肌梗死后ANP逐渐参与心肌的保护。超氧化物歧化酶(SOD)在冠脉结扎4h后开始下调,在24h时有所恢复,表明心肌缺血4h后出现氧化应激反应。FKBP12.6的表达无明显异常,表明发生AMI后,在最初的24h内未出现心肌细胞肌浆网钙释放异常。2、采用全细胞膜片钳技术分别记录各实验组ICa·L加药前后的变化,所采用数据分别为加药前20s和加药后150s,统计结果(单位：pA/pF)如下：对照组为8.40±0.21和7.4±0.26；n=3、0.05%组为9.35±0.30和8.22±0.48,n=3；0.1%组为5.32±0.37和2.50±0.20,n=3；0.2%组为6.35±0.29和2.54±0.23,n=3。经ANOVA分析显示对照组和0.05%组加药前后ICa·L变化不明显(P>0.05),0.1%组和0.2%组加药前后ICa·L变化明显(P<0.05),表明低浓度Tween-80对心肌细胞的ICa·L影响不大,高浓度Tween-80能够抑制ICa·L。ICa·L衰减幅度分别为,对照组11.2%±5%,n=3；0.05%组12.0%±3.2%,n=3；0.1%组52.7%±6.5%,n=3；0.2%组59.9%±4.5%,n=3,两两比对,对照组与0.05%组没有显著性差异(P>0.05),其余两组与对照组相比有显著性差异(P<0.05),说明0.1%和0.2%组电流衰减有统计学意义,0.1%和0.2%两组之间没有显著性差异(P>0.05),说明两组电流衰减没有统计学意义,提示Tween-80浓度达到0.1%时,电流衰减趋于峰值,随着Tween-80浓度增加,电流衰减幅度增加不明显。3.PSEN1基因敲除小鼠发育异常,整胚研究结果如下：血管发育异常、脑发育异常、生长发育迟缓、肢体发育不全；心脏组织学分析结果如下：心室扩张、室壁变薄、室间隔缺损与增厚、瓣膜肥大、肺动脉双出口、冠脉形成抑制。为了更深入的研究,我们构建了小鼠心肌细胞分离平台,分选获得单个小鼠心肌细胞,细胞状态良好,边缘光滑、Z线清晰,为后续研究工作打下良好的基础。结论：1、心肌梗死相关基因的表达水平在不同生理过程中出现波动性变化,本实验研究发现一些棚关标志分子基因的表达具有时间依赖性,结合激光扫描共聚焦显微镜和电镜技术,从分子机制和形态学两方面研究了心肌梗死的病理、生理变化，为心肌梗死的临床研究和治疗提供了理论依据；2、在细胞水平研究了Tween-80对心肌细胞ICa·L的影响,低浓度Tween-80对心肌细胞的影响微弱,当浓度达到0.1%时,电流衰减幅度趋于峰值,因此0.1%Tween-80可被看作心肌细胞损伤的一个危险指标,为规范Tween-80的生物医疗应用提供一个新的标准：3、本实验从整胚水平研究丫PSEN1对小鼠心脑血管发育的影响,发现PSEN1基因敲除小鼠生长发育迟缓、心脑血管发育缺陷,拓宽了我们对PSEN1基因功能的认识。利用自研的心肌细胞分离平台,成功分离了小鼠心肌细胞,为进一步研究PSEN1基因的功能奠定了基础。

心肌梗死基因表达检测及心肌细胞分离平台的搭建

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