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中国玉米南方锈菌的分子遗传多样性和超微结构研究
作 者: 邢国珍
导 师: 郑文明
学 校: 河南农业大学
专 业: 细胞生物学
关键词: 玉米南方锈菌 玉米普通锈菌 遗传多样性 分子进化 分子检测 超微结构
分类号: S435.131.4
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
玉米是重要的粮食作物,也是重要的工业生产原料。而玉米南方锈病日益严重的发生,严重影响了玉米的产量和品质。控制玉米锈病的根本途径是利用玉米的抗病性,认识玉米锈菌的分子遗传多样性和侵染组织的超微结构对抗病育种和抗病品种的合理布局以及了解玉米抗锈机制,都有重要的价值。本研究利用分子生物学手段对我国海南、河南等地的玉米南方锈菌群体进行了分子遗传多样性分析,并对玉米南方锈菌超微结构进行了观察,主要研究结果如下:1.利用rDNA+ITS基因序列以及β-tubulin基因序列片段设计的特异引物,对采自海南的11个,河南的13个,重庆的1个和吉林的1个锈菌样品的基因组DNA进行扩增,克隆测序(GeneBank登录号为:HM452902,HQ154021~HQ154038;HM452903,HM452904,HQ162104~HQ162124),用于玉米南方锈菌的分子多样性分析。2.分别利用rDNA+ITS和β-tubulin基因序列片段构建系统进化树,结果显示:采自海南、河南、重庆的菌株属于玉米南方锈菌,而采自吉林的菌株属于玉米普通锈菌。玉米南方锈菌不同菌系之间的rDNA+ITS基因片段序列相似度在99.12%-100%之间,而与玉米普通锈菌的序列相似度在56.32%-63.96%之间;而不同菌系的β-tubulin基因片段序列相似度则分别达98.97%-99.91%和80.90%-81.25%。海南和河南玉米南方锈菌群体由测定的基因序列展示的DNA分子遗传多样性整体不高,锈菌分离系也不能按地区聚为组群,说明地区之间没有明显的亚群体遗传分化,地区群体之间可能存在着频繁的传播关系。3.建立了玉米南方锈菌和玉米普通锈菌PCR检测的特异性检测引物(专利号:201010606982.0;201010606639.6)。利用玉米南方锈菌和普通锈菌的rDNA+ITS基因片段序列,分别设计出能够扩增特异片段的引物对,并利用玉米常见病菌玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、玉米弯孢霉叶斑病菌(Curvularia lunata)以及玉米基因组DNA做对照,结果证明引物对的特异性非常高。在优化建立的PCR检测条件下,引物最低检测量分别是10pg和1pg,灵敏度要求可以满足对玉米锈菌处于潜伏期的检测,可以用于病害预警预报。4.利用扫描电镜技术对玉米南方锈菌叶表形态进行了观察,可以看到南方锈菌夏孢子呈球形或椭圆形,大小为(10~20)μm×(25~35)μm,表面具大量圆锥形刺突,密致、交错排列,刺突周围呈现微微向下凹陷的圆形的脊;夏孢子堆散生,长卵形,顶破表皮突出叶面,可以连生,成熟的夏孢子在孢子堆四周散落分布。5.首次利用透射电镜技术对玉米锈菌的寄主组织内结构进行了观察,结果显示:玉米锈菌的胞间菌丝呈现出典型的丝状,其生长和分枝均表现出沿寄主细胞表面而延伸;吸器母细胞在与寄主细胞壁接触部位发育形成入侵栓,入侵栓穿透寄主细胞壁后,继续在寄主细胞内延伸,其顶端部分渐渐膨大成球形的吸器体,因而成熟的吸器呈现出由管状的颈部和顶端膨大的吸器体两部分构成。6.通过透射电镜观察到在不同的感病玉米品种中锈菌的核相具有不同的呈现情况,与小麦条锈菌经常观察到多核菌丝的情况不同的是:在玉米郑丹958品种中菌丝细胞核多为双核,而在玉米先玉335品种中菌丝则多为单核,因此不同的玉米品种对菌丝核相的呈现情况之间是否有某种具体的关系,还需要进一步通过比较分析更多的感病玉米品种中锈菌菌丝核相的呈现情况而做出准确的结论。
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全文目录
致谢 4-8摘要 8-10第一章 文献综述 10-19 1 玉米锈病的研究概况 10-11 1.1 玉米锈病的世界发生情况 10 1.2 玉米锈病在我国的发生和流行 10-11 1.3 玉米锈菌及其危害 11 2 用于植物病原真菌遗传学研究的主要分子标记 11-15 2.1 限制性片段长度多态性(RFLP) 12 2.2 随机扩增多态性DNA(RAPD) 12 2.3 扩增片段长度多态性(AFLP) 12-13 2.4 rDNA 和内部转录间隔区(ITS) 13-14 2.5 β-tubulin 基因片段序列 14 2.6 简单重复序列(SSR) 14-15 3 植物病原真菌分子检测的主要方法 15-17 3.1 聚合酶链式(PCR)技术 16 3.2 Southern 印迹杂交 16 3.3 实时荧光定量PCR 技术 16-17 3.4 基因芯片技术 17 4 植物病原真菌超微结构观察研究 17-18 5 本研究目的和意义 18-19第二章 玉米锈菌的分子遗传多样性分析 19-31 2.1 材料和方法 19-22 2.1.1 样品的采集 19-20 2.1.2 DNA 的提取 20-21 2.1.3 rDNA+ITS 片段序列的克隆、测序 21 2.1.4 β-tubulin 基因片段序列的克隆、测序 21-22 2.1.5 序列比对及系统进化树的构建 22 2.2 结果与分析 22-29 2.2.1 ITS1 和ITS4 引物的扩增结果 22 2.2.2 SP1 和ITS4 引物的扩增结果 22-23 2.2.3 Tubulin- F 和Tubulin- R 引物的扩增结果 23 2.2.4 rDNA+ITS 序列片段结果 23-25 2.2.5 β-tubulin 基因序列片段分析 25-28 2.2.6 群体遗传多样性分析 28-29 2.3 讨论 29-31第三章 玉米锈菌的分子检测方法研究 31-36 3.1 材料和方法 31-32 3.1.1 样品的采集 31 3.1.2 DNA 的提取 31 3.1.3 特异引物的设计及合成 31-32 3.1.4 PCR 体系的优化 32 3.1.5 引物的特异性检测 32 3.1.6 引物的灵敏度检测 32 3.2 结果与分析 32-34 3.2.1 PCR 体系的优化分析 32-33 3.2.2 引物的特异性检测结果 33 3.2.3 引物的灵敏度检测结果 33-34 3.3 讨论 34-36第四章 玉米南方锈菌的超微结构研究 36-42 4.1 材料和方法 36-37 4.1.1 材料的采集 36 4.1.2 电镜样品的制备 36-37 4.1.2.1 扫描电镜样品的制备 36 4.1.2.2 透射电镜样品的制备 36-37 4.2 结果与分析 37-40 4.2.1 胞间菌丝 37 4.2.2 吸器母细胞及吸器 37-38 4.2.3 不同品种上的菌丝核相 38 4.2.4 寄主细胞对入侵的反应 38-39 4.2.5 夏孢子的形成 39-40 4.3 讨论 40-42第六章 小结 42-44参考文献 44-50ABSTRACT 50-52附录 52
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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 玉米病虫害 > 玉米病害 > 侵(传)染性病害
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