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树鼩和猕猴精子冷冻保存工艺的创建和优化的研究

作　者: 平述煌
导　师: 杨世华
学　校: 昆明理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 精子树鼩猕猴冷冻保存超微结构
分类号: S865.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

精子是一种重要的生物遗传资源,精子冷冻特性的研究是实验动物快速繁殖、家畜生产繁殖、生物资源多样性保护及人类不孕不育治疗的重要研究内容。树鼩和猕猴因其遗传进化和生理特性非常接近于人类而被广泛应用于生物医学的相关研究中。由于对树鼩和猕猴的生殖生物学、低温生物学、精子的冷冻损伤机制及某些物质的冷冻保护机理的了解和认识不够,而导致冷冻精子的存活率和受精能力降低。因此,有必要对影响树鼩和猕猴精子冷冻保存的因素进行探讨,以便弄清精子冷冻特性和进一步提高精子的冷冻保存效率本论文以树嗣和猕猴精子为实验材料,以精子运动度、顶体完整率和体外受精或人工授精的受精率作为冷冻精子存活能力的检测指标,探讨树鼦和猕猴精子的冷冻特性和相关影响因素：(1)比较研究了不同卵黄浓度、冷冻降温速率、冷冻降温平衡时间和冷冻稀释液对树鼦精子冷冻存活率的影响,探明了树鼦精子在含卵黄冷冻液中的冷冻特性,发现卵黄浓度为20%、冷冻降温速率为-172℃/min、冷冻降温平衡时间为10min、冷冻稀释液为TTE时,树鼦精子的冷冻存活率最高,并具有体内的受精能力；(2)比较研究了甘油、二甲基亚砜、乙二醇和丙二醇对树鼩精子冷冻保存的影响,确定了这四种渗透性防冻剂在树鼩精子冷冻过程中保护特性,表明3％DMSO具有最佳的冷冻保护能力,进一步提高了树晌精子的冷冻存活率；(3)利用扫描电子显微镜和透射电子显微镜对树鼦附睾精子的超微结构进行了观察和分析,结果发现树鼩精子的头部呈现圆形或卵圆形,头部长度、宽度平均分别为6.65和5.82μm,精子尾部中段、主段、尾部和精子总长度平均分别为13.39,52.35,65.74和73.05μm,尾部中段的线粒体螺旋数量大约为48个,其轴丝结构为典型的“9+9+2”结构,从结构特征上与其他哺乳动物相似,但是大小有较明显的差别；(4)比较研究了不同浓度的乙二醇以及最佳乙二醇浓度下的冷冻降温速率和冷冻降温平衡时间对猕猴精子冷冻保存的影响,确定了猕猴精子冷冻保存的最佳乙二醇浓度、降温速率和冷冻降温平衡时间,并且乙二醇冷冻精子具有体外受精能力,表明乙二醇冷冻精子具有甘油冷冻精子相似的受精能力和体外胚胎发育率；(5)研究了精浆对猕猴精子冷冻保存的影响,发现精浆有利于提高个体猕猴精子抗冷休克的能力和改善冷冻精子的冷冻存活率,精子耐冻猕猴精液的精浆能够提高精子不耐冻猕猴供体精子的抗冻性能。本实验研究首次建立了树鼦精子采集、稀释、冷冻保存以及体内受精的方法,探讨了树鼦精子冷冻保存的特性,为树鼦的种质资源保存、人工繁殖和胚胎生物学研究以及转基因树鼦的研究奠定了必须的基础；猕猴精子的冷冻保存方法的改进和精浆对个体冷冻保护能力研究,进一步探讨了猕猴精子冷冻特性,为提高冷冻精子的存活率和受精能力填补了重要信息。本研究的结果不仅为解决了本物种的种质资源保存问题提供必须的实验技术,也为进一步推动低温生物学、生殖生物学和发育生物学的发展,以及为生物多样性的保护、野生种质资源的保存和动物种群状复提供重要的技术支撑。

全文目录

摘要 4-6ABSTRACT 6-12插图和附表清单 12-13缩略词 13-14第一章绪论 14-23 1.1 树鼩生殖生物学的基础研究 14 1.2 猕猴生殖生物学的基础研究 14-15 1.3 精子冷冻保存技术 15-21 1.3.1 精子采集的方法 16 1.3.1.1 活体采精 16 1.3.1.2 附睾离体取精 16 1.3.2 冷冻前精液的预处理方法 16-17 1.3.2.1 精子的优选 16-17 1.3.2.2 预冷处理 17 1.3.3 冷冻液和防冻剂 17-18 1.3.3.1 冷冻稀释液的类型和作用 17 1.3.3.2 防冻剂的类型 17-18 1.3.3.3 防冻剂的加入与去除方式 18 1.3.4 冷冻与解冻方法 18-20 1.3.4.1 快速冷冻法 18-19 1.3.4.2 慢速冷冻法 19 1.3.4.3 玻璃化冷冻法 19 1.3.4.4 定向结冰精子冷冻法 19 1.3.4.5 干燥冷冻法 19-20 1.3.5 精液品质的评定 20-21 1.3.5.1 结构完整性检测 20 1.3.5.2 功能检测 20-21 1.4 本文研究的目的和意义 21-23第二章卵黄浓度、冷冻降温速率和冷冻稀释液对树鼩精子冷冻的影响 23-40 2.1 引言 23-24 2.2 材料与方法 24-30 2.2.1 实验动物 24 2.2.2 实验器材 24-25 2.2.3 精子冷冻液和洗涤液的配制 25 2.2.4 精子采集 25-27 2.2.5 实验设计 27-29 2.2.5.1 实验一:卵黄对不同温度下树鼩精子储存的的保护作用 27 2.2.5.2 实验二:不同卵黄浓度对树鼩精子预冷处理的影响 27 2.2.5.3 实验三:比较不同卵黄浓度和降温速率对树鼩精子冷冻存活率的影响 27 2.2.5.4 实验四:不同冷冻降温平衡时间对树鼩精子冷冻存活率的影响 27-28 2.2.5.5 实验五:比较TTE和TEST对精子冷冻保存的影响 28 2.2.5.6 实验六:评估冷冻精子的受精能力 28-29 2.2.6 冷冻过程中降温速率的检测 29 2.2.7 精子功能检测 29-30 2.2.7.1 精子总数和运动度的检测 29 2.2.7.2 顶体完整率检测 29-30 2.2.8 统计分析 30 2.3 结果 30-37 2.3.1 实验一:卵黄对不同温度下精子储存时间的影响 30 2.3.2 实验二:不同卵黄浓度对精子预处理的影响 30-31 2.3.3 实验三:不同卵黄浓度和降温速率对精子冷冻的影响 31-35 2.3.4 实验四:不同冷冻降温平衡时间对树鼩精子冷冻存活率的影响 35 2.3.5 比较TTE和TEST对精子冷冻效果的影响 35-37 2.3.6 冷冻精子的受精能力 37 2.4 讨论 37-40第三章渗透性防冻剂对树鼩精子冷冻保存的影响 40-49 3.1 引言 40 3.2 实验材料和方法 40-42 3.2.1 实验动物 40 3.2.2 实验器材 40 3.2.3 精子冷冻稀释液和洗涤液的配制 40-41 3.2.4 精子采集 41 3.2.5 实验设计 41-42 3.2.5.1 实验一:防冻剂的低温毒性实验 41 3.2.5.2 实验二:渗透性防冻剂对树鼩精子冷冻存活率的影响 41-42 3.2.5.3 实验三:评估冷冻精子的受精能力 42 3.2.6 精子功能检测 42 3.2.6.1 精子总数和运动度的检测 42 3.2.6.2 顶体完整率检测 42 3.2.7 统计分析 42 3.3 实验结果 42-46 3.3.1 实验一:防冻剂的毒性实验 42-43 3.3.2 实验二:渗透性防冻剂对树鼩精子冷冻存活率的影响 43-46 3.3.3 实验三:评估冷冻精子的受精能力 46 3.4 讨论 46-49第四章树鼩精子的超微结构 49-60 4.1 引言 49 4.2 材料和方法 49-51 4.2.1 实验动物 49 4.2.2 实验器材 49-50 4.2.3 试剂 50 4.2.4 精子采集 50 4.2.5 精子冷冻与解冻 50 4.2.6 精子质量的评估 50-51 4.2.7 扫描电镜观察样品的处理 51 4.2.8 透射电镜观察样品的处理 51 4.3 实验结果 51-58 4.3.1 树鼩睾丸相关参数的测定和精液特性 51-52 4.3.2 正常树鼩精子的超微结构 52-55 4.3.3 冷冻/解冻后树鼩精子形态结构的变化 55-58 4.4 讨论 58-60第五章乙二醇浓度、冷冻降温速率和平衡时间对猕猴精子冷冻存活率的影响 60-72 5.1 引言 60-61 5.2 材料与方法 61-65 5.2.1 实验动物 61 5.2.2 实验器材仪器设备及耗材 61 5.2.3 精子冷冻液和洗涤液及其配制 61 5.2.4 精液采集 61-62 5.2.5 精子功能性评价 62-63 5.2.5.1 精子运动度 62 5.2.5.2 顶体完整率 62-63 5.2.5.3 体外受精 63 5.2.6 精液冷冻及其实验设计 63-64 5.2.6.1 实验一:乙二醇浓度对猕猴精子冷冻存活率的影响 63-64 5.2.6.2 实验二:冷冻降温速率对猕猴精子冷冻存活率的影响 64 5.2.6.3 实验三:冷冻降温平衡时间对猕猴精子冷冻存活率的影响 64 5.2.6.4 实验四:比较EG和Gly冷冻精子的受精能力 64 5.2.7 统计分析 64-65 5.3 实验结果 65-70 5.3.1 实验一:乙二醇浓度对猕猴精子冷冻存活率的影响 65-67 5.3.2 实验二:降温速率对猕猴精子冷冻存活率的影响 67-68 5.3.3 实验三:冷冻降温平衡时间对精子冷冻保存的影响 68 5.3.4 实验四:比较EG和Gly冷冻精子的受精能力 68-70 5.4 讨论 70-72第六章精浆对猕猴精子冷冻保存的影响 72-83 6.1 引言 72 6.2 实验材料和方法 72-75 6.2.1 实验动物 72 6.2.2 实验仪器 72 6.2.3 精子洗涤液和冷冻液及其配制 72-73 6.2.4 精液采集 73 6.2.5 精子功能性评价 73 6.2.5.1 精子密度和运动度 73 6.2.5.2 精子顶体完整率 73 6.2.6 实验设计 73-74 6.2.6.1 实验一:精浆对猕猴精子抗冷休克的影响 73-74 6.2.6.2 实验二:精浆对猕猴精子冷冻存活率的影响 74 6.2.6.3 实验三:耐冻猕猴精液中精浆对不耐冻精液中的冷冻保存的影响 74 6.2.7 统计分析 74-75 6.3 实验结果 75-80 6.3.1 实验一:精浆对猕猴精子抗冷休克的影响 75-76 6.3.2 实验二:精浆对猕猴精子冷冻存活率的影响 76-79 6.3.3 实验三:添加来自于耐冻猕猴精液中的精浆到不耐冻精液中的冷冻保护作用 79-80 6.4 讨论 80-83第七章结论 83-86致谢 86-88参考文献 88-102附录A 攻读硕士期间发表论文目录 102

树鼩和猕猴精子冷冻保存工艺的创建和优化的研究

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