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甘蔗己糖转运蛋白基因启动子pPST2a的功能研究

作　者: 马滋蔓
导　师: 杨本鹏
学　校: 海南大学
专　业: 种质资源
关键词: 甘蔗 植物启动子 农杆菌介导法 遗传转化
分类号: S566.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 62次
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内容摘要


启动子是基因表达调控的重要元件。在转基因植物中,启动子是影响转基因表达效率的重要因素之一,选择高效率的启动子是高效率表达外源基因的关键。组成型启动子,在转基因植物的研究中得到了广泛运用。但是组成型启动子不能从时间和空间上有效地调控目的基因的表达,在作物的遗传改良中存在一定的缺陷。组织特异启动子作为一类专一性启动子,能指导外源基因在植物发育过程中某一特定时空表达,它不仅能使目的基因的表达产物在一定空间积累,增加区域表达量,避免植物营养的浪费。因此,寻找一个在甘蔗中高效表达或者特异的启动子,对甘蔗遗传改良有重要义。本实验室克隆了甘蔗己糖转运蛋白基因PST2a基因5’上游1968bp的启动子序列,命名为pPST2a。为了进一步鉴定它的功能,我们构建了它一系列的缺失表达载体：pCBI1900、pCBI1600、pCBI1300、pCBI1100;又通过农杆菌介导法对甘蔗进行了遗传转化并获得一批转化植株；对这些转化植株分别进行了GUS基因的PCR检测,证实获得转pCBI1900、pCBI1600、pCBI1300和pCBI1100的阳性植株分别为16、33、29、和21株；从每个载体获得的转基因植株中,选出生长良好的,进行根、茎、叶、叶芽、叶鞘、五个部位的GUS基因表达的检测(GUS组织化学染色定位法),证明GUS基因在转pCBI1900、pCBI1600和pCBI1300植株中的根部均有表达,而其余部位未见其表达；转pCBI1100植株中,任何部位均没有表达；证明了pCBI1900、pCBI1600、pCBI1300具有根部特异表达的活性。说明pPST2a具有甘蔗根特异表达的特性。为了进一步研究此启动子在其它植株中的表达特性,我们又利用农杆菌介导法把它们转入烟草,经GUS基因PCR鉴定,获得27株转pCBI1900和33株转pCBI1600的阳性植株,对转基因烟草的进一步研究还在进行之中。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-11
1 引言与文献综述  11-35
  1.1 甘蔗概况  11-13
    1.1.1 甘蔗在农业生产中的重要性  11
    1.1.2 甘蔗的主要用途  11-12
    1.1.3 甘蔗副产品的用途  12
    1.1.4 甘蔗在生物领域作为转基因受体的优点  12-13
  1.2 植物基因启动子的研究  13-29
    1.2.1 植物基因启动子性质  13
    1.2.2 组成型启动子  13-15
    1.2.3 组织特异性启动子  15-22
      1.2.3.1 营养器官中的表达启动子  15-18
      1.2.3.2 生殖器官表达的特异启动子  18-22
    1.2.4 诱导型启动子  22-28
      1.2.4.1 光诱导启动子  22-23
      1.2.4.2 热诱导表达启动子  23-24
      1.2.4.3 创伤诱导启动子  24
      1.2.4.4 激素诱导表达启动子  24-27
      1.2.4.5 真菌和共生菌诱导表达启动子  27-28
    1.2.5 植物基因启动子的人工改造及运用前景  28-29
  1.3 甘蔗启动子的研究  29-30
    1.3.1 甘蔗启动子研究的重要意义  29
    1.3.2 甘蔗的启动子的研究进展  29-30
  1.4 甘蔗遗传转化的方法  30-32
    1.4.1 农杆菌介导法  30-32
      1.4.1.1 农杆菌介导的转化机理  30-31
      1.4.1.2 农杆菌转化系统的特点  31-32
      1.4.1.3 农杆菌介导植物转化技术在禾本科植物中的应用  32
  1.5 本论文研究的目的、内容和技术路线  32-35
    1.5.1 研究目的  32-33
    1.5.2 研究内容  33-34
    1.5.3 技术路线  34-35
2 材料与方法  35-49
  2.1 材料与试剂  35-36
    2.1.1 植物材料  35
    2.1.2 质粒及菌种  35
    2.1.3 试剂  35
    2.1.4 主要仪器设备  35
    2.1.5 PCR引物  35-36
  2.2 常用药品、培养基及其试剂的配制  36
    2.2.1 培养基配制  36
    2.2.2 溶液配制  36
  2.3 实验所用试剂配制  36-37
    2.3.1 总DNA提取  36
    2.3.2 质粒DNA提取  36
    2.3.3 GUS组织化学染色试剂  36-37
  2.4 实验方法  37-44
    2.4.1 PST2A基因启动子系列缺失及缺失表达载体的构建  37-41
      2.4.1.1 PST2A基因启动子系列缺失  37
      2.4.1.2 PCR扩增PST2A基因启动子  37-38
      2.4.1.3 PCR产物回收  38
      2.4.1.4 目的片段与T载体的连接  38
      2.4.1.5 大肠杆菌感受态的制备  38-39
      2.4.1.6 大肠杆菌感受态的检测和转化方法  39
      2.4.1.7 小量提取质粒  39-40
      2.4.1.8 聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA  40
      2.4.1.9 重组子的酶切鉴定  40-41
    2.4.2 缺失表达载体的构建  41-42
      2.4.2.1 酶切  41
      2.4.2.2 连接  41-42
    2.4.3 PCBI1900、PCBI1600、PCBI1300、PCBI1100植物表达载体转化农杆菌  42
      2.4.3.1 农杆菌感受态细胞的制备  42
      2.4.3.2 农杆菌感受态细胞的转化  42
    2.4.4 菌株鉴定  42-44
      2.4.4.1 质粒的提取  42-43
      2.4.4.2 PCBI1900、PCBI1600、PCBI1300、PCBI1100 PCR鉴定  43
      2.4.4.3 PCBI1900、PCBI1600、PCBI1300、PCBI1100酶切鉴定  43-44
  2.5 PCBI1900、PCBI1600、PCBI1300、PCBI1100表达载体遗传转化甘蔗  44-46
    2.5.1 甘蔗转化材料及其农杆菌菌液的准备  44-45
      2.5.1.1 几种主要的甘蔗培养基  44
      2.5.1.2 甘蔗愈伤组织的培养  44
      2.5.1.3 农杆菌菌液的制备  44-45
    2.5.2 农杆菌菌液浸染愈伤组织  45
    2.5.3 侵染后愈伤组织的共培养及洗涤  45
    2.5.4 预检测侵染效率  45
    2.5.5 浸染后的愈伤组织分化  45
    2.5.6 甘蔗植株的筛选培养  45
    2.5.7 甘蔗抗性小苗的定植  45-46
  2.6 抗性甘蔗植株的PCR检测  46-47
    2.6.1 甘蔗总DNA的小量提取  46
    2.6.2 转化甘蔗的GUS基因PCR检测  46-47
  2.7 转PCBI1900、PCBI1600、PCBI1300、PCBI1100植株GUS组织化学染色结果  47
  2.8 PCBI1900 PCBI1600表达载体遗传转化烟草  47-49
    2.8.1 烟草转化材料及其农杆菌菌液的准备  47-48
      2.8.1.1 烟草主要的培养基  47-48
      2.8.1.2 烟草无菌外植体的获得  48
    2.8.2 农杆菌介导法转化烟草  48
      2.8.2.1 农杆菌菌液的制备  48
      2.8.2.2 农杆菌菌液浸染烟草叶片  48
    2.8.3 侵染后烟草叶片的共培养  48-49
    2.8.4 浸染后的烟草叶片组织分化  49
    2.8.5 烟草的筛选培养  49
    2.8.6 烟草抗性小苗的定植  49
  2.9 抗性烟草植株的PCR检测  49
    2.9.1 烟草总DNA的小量提取  49
    2.9.2 转化植株的PCR检测  49
3 结果与分析  49-63
  3.1 PST2A基因启动子系列缺失及缺失表达载体的构建  49-52
    3.1.1 PST2A基因启动子系列缺失  49-50
    3.1.2 各表达载体的构建  50-52
  3.2 PCBI1900、PCBI1600、PCBI1300、PCBI1100植物表达载体的农杆菌转化和鉴定  52-53
    3.2.1 植物表达载体PCR鉴定  52
    3.2.2 植物表达载体的酶切鉴定  52-53
  3.3 农杆菌介导的甘蔗转化  53-56
    3.3.1 农杆菌介导法转化甘蔗愈伤组织及甘蔗小苗分化与筛选过程  53-56
      3.3.1.1 农杆菌菌液侵染甘蔗  53
      3.3.1.2 GUS染色法检测侵染效率  53
      3.3.1.3 侵染后植株的筛选和培养  53
      3.3.1.4 抗性植株的培养  53-56
  3.4 转化甘蔗植株的分子检测  56-58
    3.4.1 PCR检测  56-58
      3.4.1.1 甘蔗总DNA的提取  56
      3.4.1.2 转PCBI1900抗性植株的GUS基因PCR检测  56
      3.4.1.3 转PCBI1600抗性植株的GUS基因PCR检测  56-57
      3.4.1.4 转PCBI1300抗性植株的GUS基因PCR检测  57-58
      3.4.1.5 转PCBI1100抗性植株的GUS基因PCR检测  58
  3.5 转pCBI1900、pCBI1600、pCBI1300、pCBI1100植株GUS组织化学染色结果  58-60
  3.6 农杆菌叶盘法遗传转化烟草  60-62
  3.7 烟草的PCR检测  62-63
    3.7.1 烟草DNA的提取  62
    3.7.2 转PCBI1900抗性植株的GUS基因PCR检测  62
    3.7.3 转PCBI1600抗性植株的GUS基因PCR检测  62-63
4 讨论  63-65
  4.1 有关甘蔗抗性苗的转化效率和检测  63
  4.2 关于根部特异启动子  63-64
  4.3 关于GUS报告基因和检测  64-65
5. 结论  65
6. 本试验研究的后续工作  65
7. 参考文献  65-73
8. 缩写词  73-74
致谢  74

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 糖料作物 > 甘蔗
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