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猪流行性腹泻病毒检测方法建立及基因变异分析

作　者: 霍金耀
导　师: 陈陆
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: PEDV 多重RT-PCR 巢式RT-PCR 分子流行病学系统进化分析 S基因原核表达 ELISA ORF3基因 M基因
分类号: S852.651
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

2010年底开始，猪病毒性腹泻在我国许多地区出现暴发流行，为调查此次腹泻疫情暴发的原因，本试验建立了可同时检测PEDV、TGEV、GARV和PKV的多重RT-PCR方法，用于临床腹泻猪粪便样本的检测。为提高对PEDV检测的灵敏性和建立具有中和保护水平的抗体监测方法，本试验建立了检测PEDV的巢式RT-PCR方法及基于S蛋白的间接ELISA方法，为临床上PED流行病学及抗体水平监测提供工具。另外，本研究通过对2010～2011年15株PEDV华中地区毒株M和ORF3基因进行克隆、测序及遗传进化分析，探讨PED在我国再次暴发的原因。1. PEDV、TGEV、GARV和PKV多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用为调查导致此次我国猪腹泻疫情大面积暴发原因，本研究建立了可同时检测PEDV、TGEV、GARV和PKV的多重RT-PCR方法。应用该方法对2010～2012年华中地区190份腹泻仔猪样本进行检测，PEDV、TGEV、GARV和PKV的阳性率分别为62.11%、0.53%、7.37%和82.11%。其中，PEDV和PKV混合感染率为47.89%，PEDV和GARV混合感染率为4.74%，GARV和PKV混合感染率为7.37%，PEDV、GARV和PKV混合感染率为4.74%，未发现TGEV与其它3种病毒的混合感染。另外，有27份样本中仅检出PEDV（14.21%），57份样本只检出PKV（30%）。结果表明，此次我国大面积暴发的病毒性腹泻是多病原混合感染造成的，主要病原为PEDV，PKV在其中所起作用尚待进一步验证和研究。2. PEDV巢式RT-PCR检测方法的建立及初步应用为建立一种灵敏度高的PEDV病原检测方法，根据GenBank中公布的PEDV M基因序列，分别设计合成针对M基因的内、外2对特异性引物，在优化反应条件的基础上建立了检测PEDV的巢式RT-PCR方法。结果显示，单独使用外引物和内引物建立的常规RT-PCR方法检测限量均为50pg的PEDV RNA模板，而使用巢式RT-PCR方法可以检测到50fg的PEDV RNA模板。另外，该方法对PRRSV、CSFV、TGEV、GARV模板的RT-PCR扩增结果均为阴性。结果表明，建立的巢式RT-PCR方法特异性、敏感性良好，可以准确快速的检测出样本中微量的PEDV核酸。3. PEDV河南流行毒株S基因部分片段的原核表达及间接ELISA方法的建立为建立检测抗PEDV S蛋白抗体的间接ELISA方法，应用RT-PCR方法扩增PEDV河南流行毒株S基因794bp片段，将其克隆至原核表达载体pET-32a(+)，构建pET-32a-S重组质粒并转化至宿主菌BL21（DE3），在37℃条件下加入IPTG进行诱导表达，经SDS-PAGE分析显示该蛋白以融合蛋白形式高效表达，分子量约为46.9kD；Western-blot分析表明所表达的重组蛋白具有良好的反应原性。以纯化的S蛋白为包被抗原建立检测PED抗体的间接ELISA方法，试验确定抗原最佳包被量0.04μg/孔，血清最佳稀释度为1:100，HRP-IgG最佳稀释度为1:2000，阳性标准判定为OD450≥0.24。应用该方法对河南省不同地区23家猪场的279份血清样本进行检测，结果显示，母猪血清样本PED抗体阳性率为97.42%（227/233）；育肥和保育猪血清样本阳性率为71.74%（33/46）。结果表明，所建立的间接ELISA方法特异性、灵敏性和可重复性良好，可以用于猪群PED抗体水平监测和流行病学调查。4.2010～2011年华中地区PEDV流行毒株基因变异分析为研究PED再次在中国中部的暴发原因，对2010年10月至2011年12月之间收集于华中地区的15株PEDV流行毒株M和ORF3基因进行RT-PCR扩增、克隆、测序及分析。序列分析显示PEDV华中地区毒株M和ORF3基因有些核苷酸及氨基酸发生改变；基于M和ORF3基因的遗传进化分析显示，PEDV可以分为3个群（G1, G2, G3），15株PEDV华中地区毒株均属于第3群，与2007年韩国株、2007～2008年泰国株、2010年越南株及2010～2011年中国其它地区毒株亲缘关系密切，而与欧洲株（Br1/87）及中国现用疫苗株（CV777）亲缘关系较远。另外，15株华中地区毒株与2003～2007年中国分离株（LJB/03、JS-2004-2、DX、QH、LZC）不在同一亚群。PEDV在近年来有快速变异和进化的趋势，最近在华中地区广泛流行的PEDV毒株是一个新的基因型。

全文目录

致谢  4-6
英文缩写词表  6-7
摘要  7-9
文献综述  9-18
  1 PEDV 病原学特性  9-10
  2 病毒主要基因及其编码蛋白的功能特性  10-13
  3 PEDV 常用检测方法  13-16
  4 本研究的目的和意义  16-18
试验研究  18-48
  试验一猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、A 群轮状病毒和嵴病毒多重 RT-PCR 检测方法的建立及临床应用  18-25
    1 材料与方法  18-20
    2 结果  20-22
    3 讨论  22-25
  试验二猪流行性腹泻病毒巢式 RT-PCR 检测方法的建立及初步应用  25-30
    1 材料与方法  25-26
    2 结果  26-29
    3. 讨论  29-30
  试验三 PEDV 河南流行毒株 S 基因部分片段的原核表达及间接 ELISA 方法的建立  30-39
    1 材料与方法  30-32
    2 结果  32-37
    3 讨论  37-39
  试验四 2010～2011 年华中地区猪流行性腹泻病毒流行毒基因变异分析  39-48
    1 材料与方法  39-40
    2 结果  40-45
    3 讨论  45-48
全文总结  48-49
参考文献  49-57
英文摘要  57-60
附：作者读研期间已发表文章  60

猪流行性腹泻病毒检测方法建立及基因变异分析

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