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夏季湖光岩玛珥湖浮游细菌和浮游活性菌遗传多样性的比较

作　者: 郭倩茹
导　师: 吴灶和
学　校: 广东海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: 湖光岩玛珥湖 浮游细菌 浮游活性菌 弧菌 16S rDNA ITS基因 rpoB基因 系统发育分析 遗传多样性
分类号: Q938
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


浮游细菌是水生生态系统中多样性最高的微生物类群。其分布广泛,数量庞大,参与水生生态系统的物质代谢与能量代谢因而具有极为重要的功能与生态地位。湖光岩玛珥湖是特殊的火山口湖且完全封闭;地质年代久远,保存了一些原有的土著物种;其形成与火山活动密切相关,较其他湖泊湖光岩玛珥湖湖水化学组成成分会存在一些差异,此种环境下的微生物多样性也会与其他普通湖泊不同,因此研究和开发湖光岩玛珥湖的微生物资源具有相当高的价值。本论文通过构建玛珥湖的七类常见湖泊微生物类群的克隆文库,比较研究了玛珥湖(湖光岩)浮游总菌、浮游活性菌的遗传多样性,同时通过纯培养的方法研究了弧菌的多样性。本论文选取了湖光岩水体的一个最深位点,分别采集1m(表层)、5m(中间层)和10m(近底层)的水样进行分析。提取浮游总菌的总DNA和RNA,利用通用引物扩增16S rDNA,转化实验后挑选阳性克隆测序分析。经RDP分析,获得的414(浮游总菌210条,浮游活性菌204条克隆序列)条克隆序列分属15个门类,共有32目,52科。414条克隆序列中将近一半的克隆序列(204条)属于Proteobacteria,主要有α-、β-、δ-、γ-Proteobacteria四类。其中,Alphaproteobacteria获得140条克隆序列占变形菌门的半数以上,是优势类群;得到99个克隆的Verrucomicrobia为湖光岩玛珥湖浮游细菌的次级优势类群;湖光岩的第三大优势类群为Bacteroidetes,共获得50个克隆。湖光岩玛珥湖浮游总菌和浮游活性菌的多样性因深度的不同而有差异:总体来说表层(1米)浮游细菌的多样性要略高于近地层(10米)水层的浮游细菌;表层浮游总菌的多样性略高于浮游活性菌的多样性;近地层浮游活性菌的多样性明显高于浮游总菌的多样性。本研究获得各一克隆的OD1,Spirochaetes序列,为国内外湖泊多样性研究中首例报道。为进一步分析细菌多样性在亚类群上的差异,我们使用7对通用引物对同批次的环境样品进行16S rDNA的扩增,构建了1m和10m 2个水层的湖光岩玛珥湖浮游总菌和浮游活性菌的浮霉菌门、α-变形菌亚门、β-变形菌亚门、γ-变形菌亚门、拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门等7个湖泊常见类群的克隆文库。不同水层各文库浮游总菌和浮游活性菌的多样性有差异。最后,用纯培养的方式分离玛珥湖(湖光岩)的弧菌,并同邻近的湛江港水域分离的弧菌的多样性进行了对比。从湖光岩共分离出21株形态颜色大小不相同的疑似弧菌菌株,随机选出21株分离自湛江港的疑似弧菌菌株进行实验。扩增的ITS序列通过与核酸序列库中的序列进行比对,从湛江港获得的序列中1条(N24)属于希瓦氏菌属,其他均为弧菌属细菌。而从湖光岩玛珥湖分离到的疑似弧菌均不是弧菌科的细菌。使用弧菌科细菌特异性引物扩增的rpoB基因扩增序列通过序列进行比对,从湛江港获得的18条序列均为弧菌属细菌,未扩增出分离自湖光岩的疑似弧菌菌株的rpoB基因序列。使用ITS和rpoB这2个基因作为分子标记对分离到的弧菌分类鉴定得到的结果在属的分类水平上基本一致,但是在种水平的分类鉴定上存在显著的差异。

全文目录


摘要  6-8Abstract  8-121 前言  12-22  1.1 环境微生物多样性研究方法的研究进展  12-16    1.1.1 传统方法  12-13    1.1.2 生物标记物(Biomakers)方法  13-14    1.1.3 现代分子生物学技术  14-16  1.2 湖光岩玛珥湖研究进展  16-20    1.2.1 湖光岩玛珥湖概况  16-17    1.2.2 湖光岩玛珥湖的研究现状  17-20  1.3 本课题的研究目的及意义  20-222 实验材料及方法  22-32  2.1 实验材料  22-25    2.1.1 仪器设备  22    2.1.2 试剂和溶液  22-23    2.1.3 引物  23-24    2.1.4 分析软件  24-25  2.2 实验方法  25-32    2.2.1 样品的采集、前期处理  25-26    2.2.2 环境样品总DNA 和总RNA 的提取  26-27    2.2.3 用DNase Ⅰ处理RNA  27    2.2.4 RT-PCR、PCR 扩增16S rDNA 基因  27-28    2.2.5 弧菌的分离  28-29    2.2.6 PCR 产物的纯化  29    2.2.7 感受态细胞的制备  29-30    2.2.8 连接与转化  30    2.2.9 阳性克隆的PCR 检测  30-31    2.2.10 测序与同源性分析  31-323 实验结果及分析  32-61  3.1 湖光岩玛珥湖浮游总菌与浮游活性菌的多样性  32-44    3.1.1 浮游总菌、活性菌16S rDNA 基因序列扩增结果  32-33    3.1.2 浮游总菌、活性菌16S rDNA 克隆文库的构建  33-36    3.1.3 各文库浮游菌门类统计  36-37    3.1.4 湖光岩玛珥湖浮游总菌、活性菌16S rDNA 序列同源性  37    3.1.5 湖光岩玛珥湖浮游总菌、活性菌系统发育树  37-44  3.2 湖光岩玛珥湖七类湖泊常见类群细菌多样性  44-56    3.2.1 用7 对通用引物扩增浮游总菌、活性菌16S rDNA 基因结果  44-45    3.2.2 七类湖泊常见类群16S rDNA 克隆文库的构建  45-48    3.2.3 湖光岩玛珥湖浮游总菌、活性菌七类常见类群系统发育分析  48-56  3.3 湖光岩玛珥湖弧菌的遗传多样性  56-61    3.3.1 用TCBS 选择培养基分离弧菌  56    3.3.2 rpoB 及ITS 基因序列扩增结果  56-57    3.3.3 湖光岩玛珥湖分离弧菌及海水分离弧菌序列同源性  57-614 讨论  61-77  4.1 湖光岩玛珥湖浮游总菌与浮游活性菌的多样性  61-67    4.1.1 16S rDNA 用于菌群多样性分析  61-62    4.1.2 湖光岩玛珥湖浮游细菌的遗传多样性  62-64    4.1.3 湖光岩玛珥湖浮游总菌和活性菌的系统发育和同源性  64-65    4.1.4 不同水层浮游细菌多样性差异  65-66    4.1.5 不同水层浮游总菌与浮游活性菌多样性差异  66-67  4.2 湖光岩玛珥湖七类湖泊常见类群细菌多样性  67-73    4.2.1 七类常见湖泊细菌类群16S rDNA 克隆文库的构建  67-69    4.2.2 湖光岩玛珥湖浮游细菌的系统发育和同源性  69-70    4.2.3 不同水层7 个常见类群浮游细菌多样性  70-71    4.2.4 不同文库浮游总菌和浮游活性菌多样性  71-73  4.3 湖光岩玛珥湖弧菌的遗传多样性  73-77    4.3.1 ITS 基因与rpoB 基因  73-74    4.3.2 湖光岩玛珥湖及湛江港分离弧菌的同源性  74-75    4.3.3 使用ITS 基因和rpoB 基因分类鉴定细菌的差异  75-775 结论  77-79参考文献  79-89致谢  89-90附录1  90-98附录2  98-106附录3  106-111附录4  111-116作者简历  116-117导师简介  117

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学 > 微生物生态学和地区分布
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