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PEDV S与猪IL-18联合DNA疫苗免疫效果研究

作　者: 斯琴高娃
导　师: 任晓峰
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪流行性腹泻病毒 PEDV S基因猪白细胞介素18 免疫佐剂
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的以严重的呕吐、脱水和腹泻为主要特征的猪的一种急性高度接触性肠道传染病。该病的流行给养猪业带来了巨大的损失。目前,虽然商品化PEDV疫苗已广泛使用,但该病在我国仍有流行。因此,研制安全有效的PEDV疫苗仍然是防治该病的重要研究方向。S蛋白是PEDV的重要结构蛋白,能诱导机体产生中和抗体,是研究PEDV基因工程苗的主要候选基因。本实验分别将PEDV S、PEDV S1与猪IL-18基因亚克隆到pVAX1真核表达载体中,构建了3种重组真核表达质粒pVAX1-PEDV S、pVAX1-PEDV S1和pVAX1-pIL-18。通过脂质体转染法将3个重组质粒转入BHK-21细胞中进行表达,试验结果表明,这3个基因都可以在体外进行表达,且表达的蛋白可以被PEDV和pIL-18多克隆抗体所检测。本试验利用小鼠为实验模型,共分成7个组,分别为pVAX1-PEDV S组、pVAX1-PEDV S1组、pVAX1-pIL-18组、pVAX1-PEDV S1和pVAX1-pIL-18联合免疫组、PED疫苗组、PBS组以及pVAX1组。利用淋巴细胞增殖试验、酶联免疫吸附试验等方法对不同处理组小鼠的各项免疫指标进行了检测。试验结果表明,PEDV S组和联合免疫组多数免疫指标都高于PEDV S1组,其中以联合免疫组免疫效果尤为突出。具体表现为:T淋巴细胞增殖功能,外周血中抗PEDV特异性抗体水平以及IFN-γ、IL-4的表达量,脾脏及外周血T淋巴细胞毒性作用与PEDV S1组比较都有明显的提高。综上所述,pIL-18基因作为PEDV S抗原基因分子佐剂具有免疫增强作用。为进一步研究pIL-18生物活性提供了数据,同时为新型免疫增强型抗PEDV疫苗研究提供了理论基础。

全文目录

中文摘要  10-11
英文摘要  11-12
1 前言  12-18
  1.1 猪流行性腹泻病(PED)  12
  1.2 PED 的危害及流行病学  12
  1.3 PEDV 的病原特性  12-13
    1.3.1 PEDV 的分类  12
    1.3.2 PEDV 的一般特性  12-13
    1.3.3 PEDV 的培养特性  13
  1.4 PEDV 的分子生物学研究进展  13-14
    1.4.1 PEDV 的基因组结构  13
    1.4.2 PEDV 基因组编码的蛋白  13-14
  1.5 PED 疫苗的研究进展  14-15
    1.5.1 灭活疫苗  14-15
    1.5.2 细胞弱毒疫苗  15
    1.5.3 转基因植物疫苗  15
  1.6 DNA 疫苗的研究进展  15-16
    1.6.1 DNA 疫苗概念  15
    1.6.2 DNA 疫苗优点  15-16
    1.6.3 DNA 疫苗的应用  16
  1.7 白细胞介素18  16-17
  1.8 研究的目的与意义  17-18
2 材料和方法  18-32
  2.1 试验材料  18-19
    2.1.1 质粒、工程菌、细胞株  18
    2.1.2 试验动物  18
    2.1.3 主要工具酶、抗体及分子生物学试剂盒  18
    2.1.4 主要生化试剂  18
    2.1.5 主要仪器设备  18-19
  2.2 试验方法  19-31
    2.2.1 PEDV S、S1 基因pIL-18 基因的亚克隆及其真核表达质粒的构建  19-23
    2.2.2 pIL-18 原核表达载体的构建  23-24
    2.2.3 重组质粒pET-30a-pIL-18 的诱导表达及纯化  24-25
    2.2.4 抗pIL-18 多克隆抗体的制备及鉴定  25-26
    2.2.5 pVAX1-PEDV S、pVAX1-PEDV S1 和pVAX1-pIL-18 重组质粒体外瞬时表达及其产物的检测  26
    2.2.6 pVAX1-PEDV S、pVAX1-PEDV S1 和pVAX1-pIL-18 重组质粒在小鼠体内的应用及其免疫效果的检测  26-31
  2.3 数据处理  31-32
3 结果  32-46
  3.1 PEDV S、S1 基因及pIL-18 基因的亚克隆及其真核表达质粒的构建和鉴定  32-34
    3.1.1 PEDV S、S1 重组真核表达质粒的构建和鉴定  32-33
    3.1.2 pIL-18 重组真核表达质粒的构建和鉴定  33-34
  3.2 pET-30a-pIL-18 重组蛋白的诱导表达及纯化  34-36
    3.2.1 pET-30a-pIL-18 重组蛋白的诱导表达  34-35
    3.2.2 pET-30a-pIL-18 重组蛋白的纯化  35-36
  3.3 抗pIL-18 多克隆抗体的制备和鉴定  36-37
    3.3.1 酶联免疫吸附实验（ELISA）检测多抗效价  36
    3.3.2 Western blot 检测抗pIL-18 多克隆抗体特异性  36-37
  3.4 真核表达质粒体外转染及其表达产物的检测  37-38
    3.4.1 PEDV S、S1 基因真核表达质粒体外转染及其表达产物的检测  37-38
  3.5 小鼠脾脏及外周血T 淋巴细胞增殖功能动态变化  38-40
    3.5.1 小鼠脾脏T 淋巴细胞增殖功能动态变化  38-39
    3.5.2 小鼠外周血T 淋巴细胞增殖功能动态变化  39-40
  3.6 小鼠外周血抗PEDV IgG 抗体含量动态变化  40-41
  3.7 小鼠外周血IFN-γ的检测  41-42
  3.8 小鼠外周血IL-4 的检测  42
  3.9 血清中和反应  42-43
  3.10 免疫小鼠脾脏及血液特异性细胞毒性T 淋巴细胞活性检测  43-46
    3.10.1 免疫小鼠脾脏特异性细胞毒性T 淋巴细胞活性检测  43-44
    3.10.2 免疫小鼠外周血特异性细胞毒性T 淋巴细胞活性检测  44-46
4 讨论  46-51
  4.1 PEDV S 基因与pIL-18 联合免疫设计  46
  4.2 影响DNA 疫苗免疫效果的因素  46-47
    4.2.1 免疫途径  46-47
    4.2.2 真核载体的选择  47
    4.2.3 细胞因子对DNA 疫苗的佐剂效应  47
    4.2.4 细胞因子接种剂量对免疫效果的影响  47
  4.3 重组真核表达质粒体外瞬时转染分析  47-48
  4.4 小鼠免疫后脾脏和外周血T 淋巴细胞增殖效果  48
  4.5 小鼠外周血抗PEDV IgG 抗体含量动态变化  48-49
  4.6 小鼠免疫DNA 疫苗后IFN-γ和IL-4 的动态变化分析  49
  4.7 血清中和反应分析  49
  4.8 免疫小鼠脾脏及血液特异性细胞毒性T 淋巴细胞活性  49-51
5. 结论  51-52
致谢  52-53
参考文献  53-56
附录: 主要溶液的配制  56-58
攻读硕士学位期间发表的学术论文  58

PEDV S与猪IL-18联合DNA疫苗免疫效果研究

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