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鸭圆环病毒ORF3基因的序列分析及基因表达

作　者: 魏宗
导　师: 姜世金
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸭圆环病毒 ORF3基因 序列分析 基因型 原核表达 真核表达
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus),可导致鸭的免疫抑制,对养鸭业造成危害。本研究通过DuCV ORF3的片段大小对DuCV进行了基因型分类,并通过原核表达和真核表达对ORF3的功能进行了初步研究。1、鸭圆环病毒ORF3基因克隆测序及序列分析为了解DuCV不同分离株的ORF3基因变异情况以及分析它们的同源性,本研究从临床病料中对DuCV的ORF3基因进行了克隆测序,结果获得了10株DuCV的ORF3基因序列,并与GenBank登录的45株DuCV的ORF3基因进行同源性分析,结果表明所有DuCV的ORF3基因根据大小及同源性差异分为两个基因型:基因1型和基因2型。同一基因型之间的核苷酸同源性为95.8%～100%,氨基酸同源性为88.6%～100%,而不同基因型之间的核苷酸同源性仅为87.8%～91.6%,氨基酸同源性仅为72.2%～81.0%。55个毒株中的36个属于基因1型,ORF3基因大小为237bp,编码78个氨基酸的蛋白;19个毒株属于基因2型,ORF3基因大小为297bp,编码98个氨基酸的蛋白。本研究获得的10株DuCV的ORF3基因9株属于基因1型,1株属于基因2型,说明当前我国流行的DuCV主要为ORF3基因1型。2.鸭圆环病毒FJ0601株ORF3蛋白的原核表达及其抗血清制备本研究采用PCR方法扩增出DuCV FJ0601株ORF3基因,将其克隆入原核表达载体pET-32a(+)中,构建了DuCV ORF3基因的原核表达质粒pET-32a-ORF3,将其转入宿主菌Rosetta(DE3)PLys中进行诱导表达。SDS-PAGE电泳结果表明DuCV ORF3蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达,Western-blotting检测结果显示,该蛋白作为抗原可以与DuCV的阳性血清发生抗原抗体反应,从而首次证实了DuCV的ORF3为功能性基因,在DuCV感染宿主过程中进行了表达。将原核表达的蛋白纯化后免疫小鼠,制备了抗DuCV ORF3蛋白的血清,为后续研究奠定了基础。3. DuCV ORF3基因的真核表达采用PCR方法扩增出DuCV FJ0601株的ORF3完整基因,并将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的杆状病毒转移载体pFastBacHT B中,获得重组转移载体pFast-ORF3,再将其转化DH10Bac感受态细胞,发生转座作用,通过蓝白斑筛选获得含有ORF3基因的重组杆状病毒DNA,以脂质体介导法将重组杆状病毒DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒Bacmid-ORF3。用该重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,通过Western-blotting和间接免疫荧光检测蛋白的表达。结果表明ORF3基因在昆虫细胞中获得了高效表达,表达蛋白分子量约17kD,能与ORF3蛋白原核表达制备的小鼠抗血清发生特异性反应。这为进一步研究DuCV ORF3蛋白的生物学活性奠定了坚实的基础。

全文目录


摘要  9-11
Abstract  11-13
1 引言  13-29
  1.1 鸡贫血病毒（Chicken Infection Anaemia Virus，CIAV）  13-18
    1.1.1 CIAV 的发现、命名及分布情况  13-14
    1.1.2 CIAV 的形态学及理化特性  14-15
    1.1.3 病毒基因组及编码蛋白  15
    1.1.4 CIAV 组织病理学  15-16
    1.1.5 诊断方法  16-17
      1.1.5.1 临床症状  16
      1.1.5.2 依据病理剖检变化进行诊断  16
      1.1.5.3 病原学诊断  16
      1.1.5.4 血清学诊断  16-17
      1.1.5.5 分子生物学诊断  17
    1.1.6 CIAV 的预防和防制  17-18
  1.2 猪圆环病毒（Porcine Circovirus，PCV）  18-25
    1.2.1 病原学  18-19
      1.2.1.1 病毒分类与形态  18
      1.2.1.2 病毒理化特性  18-19
    1.2.2 分子生物学特征  19-20
      1.2.2.1 病毒基因组结构  19
      1.2.2.2 病毒编码的蛋白  19-20
    1.2.3 流行病学  20-21
    1.2.4 PCV 致病机理  21-22
      1.2.4.1 PCV2 的组织嗜性和靶细胞  21
      1.2.4.2 PCV2 的致病机制  21-22
      1.2.4.3 PCV2 感染后的特异性抗体变化  22
      1.2.4.4 PCV2 发生的诱导因素  22
    1.2.5 诊断方法  22-24
      1.2.5.1 病原学方法  22-23
      1.2.5.2 血清学方法  23-24
    1.2.6 PCV 的的预防控制  24-25
  1.3 鸭圆环病毒（Duck Circovirus, DuCV）  25-29
    1.3.1 DuCV 的病原学  25
    1.3.2 鸭圆环病毒的基因组  25-27
    1.3.3 鸭圆环病毒的基因组  27
    1.3.4 鸭圆环病毒的流行病学  27
    1.3.5 鸭圆环病毒的致病机理  27-28
    1.3.6 鸭圆环病毒的诊断  28-29
2 材料与方法  29-55
  2.1 鸭圆环病毒ORF3 基因克隆测序及序列分析  29-36
    2.1.1 材料  29-30
      2.1.1.1 病料、菌种和克隆载体  29
      2.1.1.2 主要试剂  29
      2.1.1.3 主要仪器  29-30
    2.1.2 试验方法  30-36
      2.1.2.1 病毒基因组DNA 的提取  30
      2.1.2.2 鸭圆环病毒(DuCV)ORF3 基因 PCR 扩增  30-31
      2.1.2.3 电泳检测  31
      2.1.2.4 目的核苷酸克隆测序  31-34
      2.1.2.5 鸭圆环病毒（DuCV）ORF3 基因序列分析  34-36
  2.2 鸭圆环病毒 FJ0601 株 ORF3 蛋白的原核表达及功能验证  36-44
    2.2.1 材料  36-37
      2.2.1.1 载体与受体菌  36
      2.2.1.2 仪器与试剂  36-37
      2.2.1.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂  37
    2.2.2 试验方法  37-44
      2.2.2.1 引物设计与合成  37-38
      2.2.2.2 鸭圆环病毒(DuCV)ORF3 基因原核表达载体的构建  38-41
      2.2.2.3 pET-32a-C3 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达  41-44
  2.3 鸭圆环病毒ORF3 基因的真核表达  44-55
    2.3.1 材料  44-46
      2.3.1.1 质粒、细胞、受体菌及细胞培养基  44-45
      2.3.1.2 主要试剂  45
      2.3.1.3 培养基及主要试剂的配制方法  45-46
      2.3.1.4 主要仪器及设备  46
    2.3.2 试验方法  46-55
      2.3.2.1 引物设计及合成  47
      2.3.2.2 DuCV ORF3 基因重组杆状病毒转移载体的构建  47-50
      2.3.2.3 重组质粒的转座（即重组Bacmid 的构建）  50-51
      2.3.2.4 重组Bacmid DNA 的提取及鉴定  51-52
      2.3.2.5 重组杆状病毒的获得与病毒扩增  52-53
      2.3.2.6 ORF3 蛋白在sf9 昆虫细胞中的表达与检测  53-55
3 结果与分析  55-66
  3.1 克隆测序结果分析  55-60
    3.1.1 PCR 扩增及序列分析  55
    3.1.2 克隆与酶切鉴定  55-56
    3.1.3 ORF3 基因同源性分析和进化树的构建  56-60
  3.2 原核表达及抗血清制备  60-62
    3.2.1 DuCV ORF-C3 基因的 PCR 扩增结果  60
    3.2.2 pET-32a-ORF3 重组质粒的筛选和酶切鉴定  60-61
    3.2.3 重组菌菌体裂解物的凝胶电泳结果  61-62
    3.2.4 原核表达 DuCV ORF3 蛋白的 Western-blotting 检测  62
    3.2.5 制备抗DuCV ORF3 蛋白的抗血清  62
  3.3 Ⅱ型DuCV-ORF3 基因的真核表达  62-66
    3.3.1 DuCV ORF3 基因的 PCR 扩增结果  62-63
    3.3.2 pFastBac HTA-C3 重组质粒的筛选和酶切鉴定  63
    3.3.3 重组Bacmid DNA 的鉴定  63-64
    3.3.4 真核表达基因2 型DuCV ORF3 蛋白的Western-blotting 检测结果  64
    3.3.5 IFA 鉴定结果  64-66
4 讨论  66-70
5 结论  70-71
参考文献  71-79
致谢  79-80
硕士学位论文内容简介及自评  80

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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