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基于基因组重排技术的1，3-丙二醇高产菌株选育

作　者: 卢圣国
导　师: 孟庆雄
学　校: 昆明理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 1，3-丙二醇 肺炎克雷伯氏杆菌 基因组重排技术 原生质体诱变
分类号: TQ923
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


1,3-丙二醇是目前国际上公认的六大石化新产品之一,其主要功能是作为合成聚酯、聚醚和聚亚氨酯的单体。与化工合成法相比,微生物转化法生产1,3-丙二醇具有显著的优点,成为当前的研究热点。用肺炎克雷伯氏杆菌生产1,3-丙二醇具有甘油转化率高、产物浓度及产率高等优点而受到广泛关注。为提高菌株对产物和底物的耐受性,本文用原生质体紫外诱变技术和基因组重排技术分别对肺炎克雷伯氏杆菌进行进行育种,筛选高产菌株。本文的主要研究内容和结果如下：1)以KLebsiella pneumoniae ATCC 25955为出发菌株,对其原生质体制备和原生质体诱变进行了考察和研究。在原生质体制备过程中,运用滤膜去除酶解后细胞悬液中的正常菌体,简化菌体酶解过程,提高再生率及形成率。经过原生质体诱变后,以耐受高浓度甘油和1,3-丙二醇及高产酸能力为筛选方向,最终筛选到了3株高产菌株(Kp-1、Kp-4和Kp-5)。在补料发酵实验中,上述诱变菌产1,3-丙二醇能力分别为70.24、65.21和75.51 g/L,比野生菌株WT(55.78g/L)分别提高了25.92%、16.91%和35.37%。2)以肺炎克雷伯氏杆菌为研究对象,利用基因组重排技术,提高其对发酵体系中主要产物的耐受性,获得1,3-丙二醇高产菌。以含预处理后的出发菌株的补料发酵终点液的96孔板为筛选方法,利用基因组重排技术育种。筛选到的5株高产菌株(LSG1, LSG2, LSG4, LSG5, LSG6),在3升罐批次发酵中的1,3-丙二醇浓度较亲本分别提高了17.0%,19.0%,12.9%,23.9%和18.0%；甘油到1,3-丙二醇的转化率提高了17.7%,20.0%,13.3%,24.4%和17.7%。补料发酵实验中,一株最优诱变菌(LSG5)的1,3-丙二醇生产浓度、甘油转化率和产率分别较野生菌株(K-308ME)分别提高了28.7%、21.2%和28.3%。

全文目录


摘要  4-5ABSTRACT  5-7目录  7-11第一章 文献综述  11-22  1.1 1,3-丙二醇研究概况  11-17    1.1.1 1,3-丙二醇理化性质、用途及生产方法  11-12    1.1.2 微生物产1,3-丙二醇研究进展  12-17      1.1.2.1 生产菌种  12      1.1.2.2 1,3-丙二醇生物合成途径  12-14      1.1.2.3 1,3-丙二醇生物合成途径中的关键酶  14      1.1.2.4 底物及产物对菌体细胞的抑制情况  14-16      1.1.2.5 1,3-丙二醇产生菌基因工程改造研究进展  16-17  1.2 基因组重排育种研究进展  17-21    1.2.1 基因组重排技术概念及特点  17-18    1.2.2 基因组重排过程  18-20      1.2.2.1 亲本菌株的选择  18-19      1.2.2.2 原生质体递归融合  19      1.2.2.3 融合子的筛选  19-20    1.2.3 基因组重排技术的应用  20-21      1.2.3.1 提高产物产率  20      1.2.3.2 提高菌株对环境的耐受性  20      1.2.3.3 提高底物利用率和范围  20-21      1.2.3.4 提供目的表型信息  21  1.3 本课题的研究目的、意义和内容  21-22第二章 原生质体制备和原生质体紫外诱变  22-34  2.1 引言  22-23  2.2 材料与方法  23-28    2.2.1 菌株  23    2.2.2 仪器和试剂  23-24      2.2.2.1 实验仪器  23      2.2.2.2 实验试剂  23-24    2.2.3 培养基  24-25    2.2.4 培养条件  25      2.2.4.1 斜面和平板培养  25      2.2.4.2 种子培养  25      2.2.4.3 发酵培养  25    2.2.5 分析检测  25-26    2.2.6 原生质体制备方法  26-27    2.2.7 原生质体再生率和形成率的计算方法  27    2.2.8 原生质体紫外诱变方法  27-28  2.3 结果与讨论  28-33    2.3.1 原生质体制备方法比较  28-30      2.3.1.1 传统的原生质体制备方法  28-29      2.3.1.2 高纯度原生质体制备的新方法  29-30    2.3.2 原生质体诱变剂量确定及诱变菌株筛选  30-31    2.3.3 摇瓶分析  31    2.3.4 突变菌株遗传稳定性考察  31-32    2.3.5 补料发酵分析  32-33  2.4 本章小结  33-34第三章 1,3-丙二醇产生菌基因组重排育种  34-53  3.1 引言  34-35  3.2 材料与方法  35-41    3.2.1 菌种  35    3.2.2 实验仪器与试剂  35-36    3.2.3 主要培养基  36-37    3.2.4 培养方法  37-38      3.2.4.1 种子培养  37      3.2.4.2 发酵培养  37-38    3.2.5 分析方法  38-39    3.2.6 原生质体融合  39-40      3.2.6.1 原生质体的制备  39      3.2.6.2 原生质体的灭活  39      3.2.6.3 原生质体融合  39-40    3.2.7 原生质体融合率计算  40    3.2.8 补料发酵液的预处理  40    3.2.9 菌株筛选过程  40-41    3.2.10 基因组重排  41  3.3 结果与讨论  41-51    3.3.1 原生质体的灭活  41-43    3.3.2 原生质体融合  43-45      3.3.2.1 PEG分子量和浓度对融合率的影响  43-44      3.3.2.2 PEG的作用时间对融合率的影响  44-45    3.3.3 以生物量为标准筛选高产菌株的合理性  45    3.3.4 融合菌株的筛选和摇瓶发酵分析  45-47    3.3.5 融合菌株的批次发酵实验及遗传稳定性考察  47    3.3.6 一株最优融合菌的补料发酵实验  47-48    3.3.7 最优融合菌补料发酵过程中还原当量变化研究  48-51  3.4 小结  51-53第四章 结论与展望  53-55  4.1 结论  53-54  4.2 创新点  54  4.3 展望  54-55致谢  55-57参考文献  57-64附录A 攻读硕士期间发表论文目录  64-65附录B 其他需要说明的内容  65-67

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 发酵法制高级醇及多元醇
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