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霉菌蛋白酶基因的克隆、表达及水解特性的研究

作　者: 柯野
导　师: 谢明权
学　校: 华南理工大学
专　业: 微生物学
关键词: 霉菌 蛋白酶基因 克隆 序列分析 表达 定点突变 水解特性
分类号: Q936
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


霉菌是我国传统豆类发酵食品的主要生产菌种，有着悠久的应用历史。由于长期受到环境条件（高蛋白培养基）的驯化，这些霉菌具有分泌多种胞外蛋白酶的能力；这些胞外蛋白酶对植物蛋白具有高效的水解能力，特别对大豆蛋白而言，水解产物无苦味且水解程度高。目前，国内外学者对霉菌的研究主要集中于优化固体（或者液体）发酵条件来提高霉菌蛋白酶的产量或对酶学性质的研究；而对霉菌蛋白酶基因的克隆表达方面的研究鲜有报道。鉴于此，本课题对几种霉菌蛋白酶基因进行了克隆表达、定点突变和水解大豆分离蛋白等方面的研究。利用RACE和PCR技术从Actinomucor elegans、Rhizopus chinensis、Aspergillus niger和Aspergillus oryzae等几种霉菌中克隆获得3个新氨肽酶基因（GenBank登录号分别为HQ825158、JQ657815和JQ657814，下同）、2个新丝氨酸蛋白酶基因（GU356536和JF922913）；进一步获得4个丝氨酸蛋白酶基因（L19059、XM001391433、XM001824768和XM001820092）、5个酸性蛋白酶基因（XM001399818、XM001401056、D13894、AB090877和AB044079）和1个中性蛋白酶基因（AF099904）。本试验共克隆获得15个蛋白酶基因。根据生物信息学的理论和方法，对这些蛋白酶基因进行了较全面的预测和分析。结果表明，这些蛋白酶基因的密码子偏好性均不相同，并且编码的氨基酸残基长度也不一致。6种丝氨酸蛋白酶属于蛋白酶K家族，亲缘关系较近；以蛋白酶K晶体结构（PDBcode:1IC6A）作为模板进行同源建模分析可知：这些蛋白酶分子内均无二硫键，具有1个Ca2+结合位点；蛋白酶之间以及与蛋白酶K在底物结合区域、氢键、盐键和二硫键等方面均存在差异，这些差异可能是这些酶具有独特水解作用的原因。5种酸性蛋白酶属于酸性蛋白酶Asp家族，是胞外蛋白酶，亲缘关系较近；以Aspergillopepsin I晶体结构（PDB code:1IBQ B）作为模板进行同源建模可知：蛋白酶分子内均有1个二硫键，具有1个Zn2+结合位点。蛋白酶之间在活性位点的溶剂可及表面积、氢键、盐键、底物结合区域和ψ-loop结构等方面均存在差异，这些差异可能使这些蛋白酶具有独特的酶学性质。对中性蛋白酶和氨肽酶的功能位点、Motif结构和进化关系进行了分析；由于中性蛋白酶和氨肽酶未具有较为适合的同源建模模板，因此未能构建模拟出二级结构和三级结构的模型。分别将A. elegans、R. chinensis的Alp基因、A.niger的AlpI基因、A. oryzae的AlpII基因和A. elegansAmp基因克隆至表达载体pET-22b（+）上，转化至大肠杆菌BL21菌株中进行诱导表达；结果表明这些蛋白酶基因均被诱导表达出未有活性的重组蛋白酶。将蛋白酶基因克隆至表达载体pPIC9K上，电转整合至毕赤酵母Km71菌株的基因组上进行诱导表达。结果表明只有A.niger的AlpI基因、A.oryzae的AlpII基因和NpI基因能成功表达。进一步分别对3种重组蛋白酶进行了分离纯化和酶学性质研究。结果表明：重组黑曲霉AlpI在10L发酵罐中诱导表达时，发酵液的蛋白酶酶活达到4050U/mL，该酶最适反应pH值和温度分别为8.0-9.0和45℃，在pH为6.0-9.0和温度低于40℃时具有较好的热稳定性，PMSF完全抑制酶活，Ca2+、Mn2+和K+对酶具有促进作用，Zn2+、Fe2+和Mg2+都具有抑制作用。重组米曲霉AlpII在10L发酵罐中诱导表达时，发酵液的蛋白酶酶活达4100U/mL；该蛋白酶最适反应pH值和温度分别为8.5-9.5和50℃，在pH值为6.0-10.0和温度低于40℃时具有较好的稳定性；PMSF完全抑制酶活；Ca2+和Mg2+具有促进酶的作用，Zn2+、Fe2+和Mn2+具有轻微的抑制作用。重组米曲霉NpI在10L发酵罐中诱导表达时，发酵液的蛋白酶酶活达43101U/mL；该酶最适反应pH和温度分别为8.0和55℃，在pH为5.0-9.0和45℃以下具有较好的稳定性，EDTA强烈抑制酶活，Cu2+和Zn2+能显著的抑制酶活。为了提高重组蛋白酶的热稳定性利于工业的开发利用，采用定点突变技术来增加蛋白酶的二硫键。结果表明：重组米曲霉AlpII的突变酶G33C-S126C（将33位点和126位点氨基酸G和S突变为C）提高了热稳定性；但是突变酶I179C-T253C的热稳定性发生了降低；突变酶G33C-S126C-179C-T253C不能被表达。重组黑曲霉AlpI的3种突变酶（G34C-S127C、I180C-T254C和G34C-S127C-180C-T254C），均不能在毕赤酵母KM71菌株中成功表达。对米曲霉NpI的“HExxH19aaE”Motif结构中的活性位点（H429、H433和E453）进行一系列的突变，结果表明该3个位点对NpI非常重要，进一步说明该酶属于锌蛋白酶家族。以大豆蛋白为底物，考察了重组蛋白酶对大豆分离蛋白的水解能力。结果表明重组米曲霉ApII最佳温度、pH值、水解时间和加酶量分别为45℃、10.0、1-1.5h和1000U/g，此时大豆分离蛋白水解度为15.8%。重组黑曲霉ApI最佳的温度、pH值、水解时间和加酶量分别为40℃、10.0、1h和1000U/g，此时的大豆分离蛋白水解度为15.6%。重组米曲霉NpI最佳的温度、pH值、水解时间和加酶量分别为45℃、8.0、1-1.5h和1500U/g，此时的大豆分离蛋白水解度为16.4%。

全文目录


摘要  5-8
Abstract  8-11
英文缩略语  11-18
第一章 绪论  18-38
  1.1 微生物源蛋白酶的分类与来源  18-21
    1.1.1 天冬氨酸蛋白酶  19
    1.1.2 半胱氨酸蛋白酶  19-20
    1.1.3 丝氨酸蛋白酶  20
    1.1.4 金属蛋白酶  20-21
  1.2 微生物蛋白酶的生产  21-23
    1.2.1 产蛋白酶菌株的分离  21
    1.2.2 产蛋白酶菌株的培养  21-22
    1.2.3 产蛋白酶菌株的发酵  22-23
      1.2.3.1 液体发酵  22
      1.2.3.2 固体发酵  22-23
  1.3 微生物蛋白酶的分离纯化  23-24
  1.4 提高蛋白酶产量的传统方法  24-26
    1.4.1 自然选育  24-25
    1.4.2 诱变育种  25
    1.4.3 体内基因重组育种  25-26
  1.5 微生物蛋白酶的基因工程  26-29
  1.6 微生物蛋白酶的蛋白酶工程  29-33
    1.6.1 微生物蛋白酶工程的理性设计  30-31
    1.6.2 微生物蛋白酶工程的定向进化  31-32
    1.6.3 高通量筛选的定向进化  32-33
  1.7 蛋白酶对大豆蛋白水解的开发应用  33-35
  1.8 本课题的研究意义和主要研究内容  35-38
    1.8.1 本课题的研究意义  35-36
    1.8.2 本课题的主要研究内容  36-38
第二章 几种霉菌蛋白酶基因的克隆及序列分析  38-87
  2.1 材料与方法  38-52
    2.1.1 材料  38-43
      2.1.1.1 试验菌株与载体  38-39
      2.1.1.2 主要试剂  39
      2.1.1.3 克隆霉菌蛋白酶基因的引物  39-42
      2.1.1.4 培养基  42
      2.1.1.5 主要仪器  42-43
    2.1.2 方法  43-52
      2.1.2.1 霉菌菌株的活化和培养  43
      2.1.2.2 霉菌菌丝体 RNA 的提取和检测  43-44
      2.1.2.3 反转录 cDNA 第一链的合成  44
      2.1.2.4 未报道的丝氨酸蛋白酶基因的克隆  44-48
      2.1.2.5 未报道的氨肽酶基因的克隆  48-50
      2.1.2.6 已报道的蛋白酶基因的克隆  50
      2.1.2.7 对蛋白酶基因的核苷酸序列的分析  50
      2.1.2.8 密码子使用的偏好性  50
      2.1.2.9 蛋白酶序列的基本性质分析  50-51
      2.1.2.10 蛋白酶 Motif、功能位点和结构功能域的预测  51
      2.1.2.11 蛋白酶氨基酸序列分子进化分析  51
      2.1.2.12 蛋白酶的同源建模、二级结构和三级结构分析  51
      2.1.2.13 氢键数和盐键数的预测  51-52
      2.1.2.14 蛋白酶的溶剂可及表面积的预测  52
  2.2 结果与分析  52-85
    2.2.1 霉菌蛋白酶基因的克隆结果  52-57
      2.2.1.1 霉菌菌丝体 RNA 的提取结果  52
      2.2.1.2 未报道的丝氨酸蛋白酶基因和氨肽酶基因的克隆结果  52-56
      2.2.1.3 已报道的蛋白酶基因的克隆结果  56-57
    2.2.2 霉菌蛋白酶基因的序列分析  57-85
      2.2.2.1 丝氨酸蛋白酶的生物信息学分析  57-68
      2.2.2.2 酸性蛋白酶的生物信息学分析  68-78
      2.2.2.3 中性蛋白酶的生物信息学分析  78-82
      2.2.2.4 氨肽酶的生物信息学分析  82-85
  2.3 小结  85-87
    2.3.1 几种霉菌蛋白酶基因的克隆结果  85
    2.3.2 对克隆获得的蛋白酶基因的序列分析结果  85-87
第三章 蛋白酶基因的异源表达及酶学性质的研究  87-123
  3.1 材料与方法  87-100
    3.1.1 材料  87-91
      3.1.1.1 菌株与质粒  87-88
      3.1.1.2 酶与主要试剂  88
      3.1.1.3 克隆霉菌蛋白酶基因的表达引物  88-90
      3.1.1.4 主要仪器  90
      3.1.1.5 培养基及储液  90-91
    3.1.2 方法  91-100
      3.1.2.1 蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达  91-93
      3.1.2.2 蛋白酶基因在毕赤酵母中的表达  93-96
      3.1.2.3 重组蛋白酶的酶活测定  96-97
      3.1.2.4 重组蛋白酶的 SDS-PAGE 电泳鉴定  97
      3.1.2.5 重组蛋白酶的 InVision~(TM)His-tag In-gel Stain 染色鉴定  97
      3.1.2.6 重组毕赤酵母工程菌的遗传稳定性分析  97
      3.1.2.7 重组蛋白酶的纯化  97-98
      3.1.2.8 重组蛋白酶的酶谱试验  98
      3.1.2.9 重组蛋白酶的酶学性质研究  98-100
  3.2 结果与分析  100-119
    3.2.1 蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达结果  100-101
      3.2.1.1 蛋白酶基因在大肠杆菌中表达的表达载体构建结果  100
      3.2.1.2 蛋白酶基因在大肠杆菌中诱导表达结果  100-101
      3.2.1.3 从包涵体中纯化溶解重组蛋白酶的结果  101
    3.2.2 蛋白酶基因在毕赤酵母的诱导表达结果  101-119
      3.2.2.1 蛋白酶基因在毕赤酵母中表达的表达载体构建  101-102
      3.2.2.2 重组毕赤酵母的筛选和鉴定  102-103
      3.2.2.3 重组毕赤酵母菌株诱导表达重组蛋白酶的结果  103-106
      3.2.2.4 重组毕赤酵母菌株诱导表达发酵液酶活的结果  106-107
      3.2.2.5 重组毕赤酵母工程菌的遗传稳定性分析  107
      3.2.2.6 重组米曲霉 AlpII 的纯化及酶学性质结果  107-112
      3.2.2.7 重组黑曲霉 AlpI 的纯化及酶学性质结果  112-115
      3.2.2.8 重组米曲霉 NpI 的纯化及酶学性质结果  115-119
  3.3 讨论  119-120
    3.3.1 表达系统的选择  119
    3.3.2 重组蛋白酶的表达量  119-120
    3.3.3 重组蛋白酶的纯化  120
  3.4 本章小结  120-123
第四章 重组蛋白酶分子的定点突变  123-140
  4.1 材料与方法  123-128
    4.1.1 材料  123-126
      4.1.1.1 菌株与质粒  123
      4.1.1.2 酶与主要试剂  123-124
      4.1.1.3 定点突变引物  124-126
      4.1.1.4 主要仪器  126
      4.1.1.5 培养基及储液  126
    4.1.2 方法  126-128
      4.1.2.1 重组蛋白酶突变位点的确定  126-127
      4.1.2.2 定点突变的方法  127-128
      4.1.2.3 含突变位点的蛋白基因在毕赤酵母中的表达  128
      4.1.2.4 含突变位点的重组蛋白酶的纯化和性质研究  128
      4.1.2.5 突变后重组蛋白酶的结构预测分析  128
  4.2 结果与分析  128-139
    4.2.1 重组米曲霉 AlpII 的定点突变结果  128-134
      4.2.1.1 米曲霉 AlpII 二硫键突变位点的确定  128-129
      4.2.1.2 米曲霉 AlpII 二硫键突变位点的测序结果  129-130
      4.2.1.3 突变的米曲霉 AlpII 在毕赤酵母中的表达及纯化结果  130-131
      4.2.1.4 突变的重组米曲霉 AlpII 的酶学性质  131-132
      4.2.1.5 突变重组米曲霉 AlpII 的结构分析结果  132-134
    4.2.2 重组黑曲霉 AlpI 的定点突变结果  134-137
      4.2.2.1 黑曲霉 AlpI 二硫键突变位点的确定  134-135
      4.2.2.2 黑曲霉 AlpI 二硫键突变位点的测序鉴定结果  135
      4.2.2.3 突变的黑曲霉 AlpI 在毕赤酵母中的表达结果  135-136
      4.2.2.4 突变的重组黑曲霉 AlpI 的结构分析  136-137
    4.2.3 重组米曲霉 NpI 的定点突变结果  137-139
      4.2.3.1 米曲霉 NpI 基因的定点突变位点的确定  137
      4.2.3.2 米曲霉 NpI 基因的定点突变的测序结果  137-138
      4.2.3.3 突变的米曲霉 NpI 在毕赤酵母中的表达结果  138-139
  4.3 小结  139-140
第五章 3 种重组蛋白酶对大豆分离蛋白的水解作用  140-149
  5.1 材料与方法  140-142
    5.1.1 试验材料  140
    5.1.2 大豆分离蛋白水解度的测定-甲醛滴定法  140-141
    5.1.3 重组蛋白酶对大豆分离蛋白的水解  141-142
      5.1.3.1 对大豆分离蛋白的水解试验过程  141
      5.1.3.2 温度对大豆分离蛋白水解度的影响  141
      5.1.3.3 pH 对大豆分离蛋白水解度的影响  141
      5.1.3.4 水解时间对大豆分离蛋白水解度的影响  141
      5.1.3.5 加酶量对大豆分离蛋白水解度的影响  141-142
  5.3 结果与分析  142-148
    5.3.1 重组米曲霉碱性蛋白酶对大豆分离蛋白的水解结果  142-144
      5.3.1.1 温度对大豆分离蛋白水解效果的影响结果  142
      5.3.1.2 pH 对大豆分离蛋白水解效果的影响结果  142-143
      5.3.1.3 水解时间对大豆分离蛋白水解效果的影响结果  143
      5.3.1.4 加酶量对大豆分离蛋白水解效果的影响结果  143-144
    5.3.2 重组黑曲霉碱性蛋白酶对大豆分离蛋白的水解结果  144-146
      5.3.2.1 温度对大豆分离蛋白水解效果的影响结果  144-145
      5.3.2.2 pH 对大豆分离蛋白水解效果的影响结果  145
      5.3.2.3 水解时间对大豆分离蛋白水解效果的影响结果  145
      5.3.2.4 加酶量对大豆分离蛋白水解效果的影响结果  145-146
    5.3.3 重组米曲霉中性蛋白酶对大豆分离蛋白的水解结果  146-148
      5.3.3.1 温度对大豆分离蛋白水解效果的影响结果  146-147
      5.3.3.2 pH 对大豆分离蛋白水解效果的影响结果  147
      5.3.3.3 水解时间对大豆分离蛋白水解效果的影响结果  147
      5.3.3.4 加酶量对大豆分离蛋白水解效果的影响结果  147-148
  5.4 小结  148-149
结论与展望  149-153
参考文献  153-167
攻读博士学位期间取得的研究成果  167-168
致谢  168-169
附件  169

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