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腐生葡萄球菌M36耐有机溶剂脂肪酶基因的克隆与表达

作　者: 汤彦翀
导　师: 陆兆新
学　校: 南京农业大学
专　业: 食品科学
关键词: 腐生葡萄球菌 脂肪酶 基因克隆与表达 大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 定点突变
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


生物柴油是生物质能的一种形式,具有绿色、可再生、能耗低等优点,能够缓解石油即将枯竭和环境污染对人类造成的危机,成为国内外重点研究开发的热点。与传统的化学催化法相比,脂肪酶法合成生物柴油条件温和、工序简单、能耗低、绿色环保。但是由于脂肪酶成本高,有机溶剂对脂肪酶有毒性,脂肪酶具有催化特异性等因素的影响,使酶法生产生物柴油难以有较大的突破和产业化。本研究主要对耐有机溶剂脂肪酶产生菌腐生葡萄球菌M36脂肪酶基因lip3进行克隆,并在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中表达；还对lip5基因进行定点突变,以获得耐有机溶剂的重组脂肪酶。主要研究结果如下：1.腐生葡萄球菌M36脂肪酶基因的克隆。以腐生葡萄球菌M36为出发菌株,提取总DNA,采用PCR和Sitefinding-PCR的方法分别扩增出741 bp和804 bp的成熟肽基因片段,lip3和lip5, GenBank登录号分别为：FJ979867和FJ979868。2.Lip3基因在大肠杆菌中的表达及重组酶性质研究。将lip3基因与大肠杆菌胞内表达载体pET-DsbA连接,构建重组质粒pET-DsbA-lip3,转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。经过SDS-PAGE电泳、活性染色以及琼脂显色平板的检测证明了lip3的正确表达。优化诱导培养条件,结果表明：在pH8的LB培养基中培养至OD600为1.0时,加入IPTG至终浓度为0.4 mmol/L,25℃诱导培养12 h,重组酶活力最高达到25.8 U/mL。重组酶BL21/pET-DsbA-lip3通过Ni柱去除融合蛋白配体得到电泳纯的腐生葡萄球菌lip3脂肪酶蛋白,并研究重组酶的酶学性质。结果表明：重组酶BL21/pET-lip3最适反应pH为8.0,最适反应温度为25℃；对甲醇、正己烷和正庚烷等有机溶剂有较好的耐性；Mg2+和β-巯基乙醇对重组酶有一定的激活作用。3.Lip3基因在枯草芽孢杆菌中的表达及重组酶性质研究。将lip3基因与枯草芽孢杆菌载体pHT43连接,构建重组质粒pHT43-lip3,电击转化入枯草芽孢杆菌DB104内,实现了分泌型高效表达。对重组脂肪酶pHT43-lip3酶学性质进行研究,结果表明：重组酶的最适反应pH为8.0,最适反应温度为50℃；在乙醇、异丙醇、丙酮中保存1小时,酶活能保留50%以上,而异戊醇对脂肪酶的活力有提升作用；金属离子和表面活性剂中,Na+、K+和β-巯基乙醇对重组酶有一定的激活作用。4.Lip5基因的定点突变及在枯草芽孢杆菌中的表达。应用重叠延伸PCR的方法构建脂肪酶基因lip5的突变体lip5D93s,并连接枯草芽孢杆菌载体pHT43,在草芽孢杆菌DB104中进行分泌型表达。结果表明：lip5原始基因一级结构上保守的motif Gly-His-Asp-Met-Gly(91～95位),活性中心的Ser变成了Asp,确实是导致其表达没有活性的原因。对重组酶pHT43-lip5D93S勺酶学性质进行研究,结果表明：最适反应温度为40℃,最适反应pH为8.0,在异丙醇、正己烷、正庚烷、丙酮中保存1小时,酶活能保留50%以上。

全文目录


摘要  8-10ABSTRACT  10-12缩写符号  12-13表格索引  13-15图形索引  15-18第一章 文献综述  18-36  1 微生物脂肪酶研究进展  18-25    1.1 脂肪酶来源和分类  19-21    1.2 耐有机溶剂的脂肪酶  21-22      1.2.1 耐有机溶剂脂肪酶的来源  21      1.2.2 耐有机溶剂脂肪酶的特性  21-22      1.2.3 耐有机溶剂脂肪酶的优点  22    1.3 微生物脂肪酶的应用  22-25      1.3.1 脂肪酶在食品加工中的应用  22-23      1.3.2 利用脂肪酶拆分手性化合物  23-24      1.3.3 环境污染治理  24      1.3.4 脂肪酶在造纸行业中的应用  24      1.3.5 脂肪酶在药物和化妆品中的应用  24      1.3.6 脂肪酶在生物能源中的应用  24-25  2 脂肪酶的分子生物学研究  25-30    2.1 脂肪酶的分子结构  25-27      2.1.1 脂肪酶的一级结构  25      2.1.2 脂肪酶的二级结构  25-26      2.1.3 脂肪酶的三级结构  26-27    2.2 微生物脂肪酶的基因克隆与表达  27-28    2.3 微生物脂肪酶的分子改造  28-30      2.3.1 理性设计(Rational Design)  28-29      2.3.2 定向进化(Directed Evolution)  29-30  3 大肠杆菌表达系统的概述  30-33    3.1 大肠杆菌表达系统的优点  30    3.2 大肠杆菌表达系统的缺点  30-31    3.3 各种类型大肠杆菌表达系统的构成及特点  31-32      3.3.1 Lac和Tac表达系统  31      3.3.2 PL和PR表达系统  31      3.3.3 T7表达系统  31-32    3.4 大肠杆菌表达系统研究进展  32-33  4 枯草芽孢杆菌表达系统的概述  33-35    4.1 枯草芽孢杆菌的优越性  33    4.2 外源蛋白的分泌表达  33-34    4.3 信号肽和信号肽酶  34-35  5 本研究的目的意义及内容  35-36    5.1 研究目的意义  35    5.2 研究内容  35-36第二章 Staphylococcus saprophyticus M36  36-49  1 材料与方法  36-41    1.1 材料  36-38      1.1.1 主要仪器  36      1.1.2 化学试剂  36-37      1.1.3 质粒与菌株  37      1.1.4 溶液配制  37      1.1.5 PCR引物  37-38      1.1.6 培养基  38    1.2 方法  38-41      1.2.1 腐生葡萄球菌总DNA提取  38      1.2.2 紫外光谱分析法测定DNA纯度  38      1.2.3 全长目的基因lip3的PCR扩增及产物纯化  38-39      1.2.4 SiteFinding-PCR扩增目的基因lip5  39-40      1.2.5 PCR产物与载体pMD19-T的连接  40      1.2.6 大肠杆菌感受态制备  40-41      1.2.7 载体pMD19-T连接产物转化大肠杆菌感受态细胞  41      1.2.8 PCR产物的克隆、鉴定  41  2 结果与分析  41-47    2.1 腐生葡萄球菌总DNA提取  41    2.2 脂肪酶基因lip3的扩增、PCR产物的克隆、鉴定及序列测定  41-42    2.3 脂肪酶基因lip5的扩增、PCR产物的克隆、鉴定及序列测定  42-45      2.3.1 脂肪酶基因lip5内部片段的扩增、PCR产物的克隆、鉴定及序列测定  42-43      2.3.2 Site-finding PCR方法扩增脂肪酶基因lip5上下游序列  43-44      2.3.3 脂肪酶基因lip5全长基因的扩增、PCR产物的克隆、鉴定及序列测定  44-45    2.4 腐生葡萄球菌脂肪酶基因序列分析  45-46    2.5 腐生葡萄球菌脂肪酶三维模型预测  46-47  3 讨论  47  4 小结  47-49第三章 脂肪酶lip3基因在大肠杆菌中的表达及性质研究  49-69  1 材料与方法  50-58    1.1 材料  50-52      1.1.1 主要仪器和试剂  50      1.1.2 质粒与菌株  50      1.1.3 PCR引物  50-51      1.1.4 培养基  51      1.1.5 试剂的配制  51-52    1.2 方法  52-58      1.2.1 重组工程菌的构建  52-53      1.2.2 目的基因在大肠杆菌中的诱导表达  53-55      1.2.3 BL21/pET-DsbA-lip3表达条件的优化  55-56      1.2.4 蛋白浓度测定  56      1.2.5 表达产物Ni-NTA亲和层析纯化及融合蛋白配体的酶切  56-57      1.2.6 重组酶的酶学性质的测定  57-58  2 结果与分析  58-68    2.1 pET-DsbA-lip3重组质粒的构建  58-59      2.1.1 目的基因PCR扩增  58      2.1.2 pET-DsbA载体和目的基因的制备  58      2.1.3 pET-DsbA载体和目的基因的连接及鉴定  58-59    2.2 l lip3在大肠杆菌中的诱导表达  59-68      2.2.1 重组质粒稳定性检测  59      2.2.2 罗丹明B固体琼脂平板鉴定BL21/pET-DsbA-lip3表达产物  59-60      2.2.3 重组菌体表达产物的SDS-PAGE分析及活性染色分析  60-61      2.2.4 BL21/pET-DsbA-lip3表达条件的优化  61-63      2.2.5 表达产物Ni-NTA亲和层析纯化及融合蛋白配体的酶切  63-64      2.2.6 活力的测定  64-65      2.2.7 重组酶酶学性质的测定  65-68  3 讨论  68  4 小结  68-69第四章 脂肪酶基因lip3在枯草芽孢杆菌中的表达  69-80  1 材料与方法  69-73    1.1 材料  69-70      1.1.1 主要仪器和试剂  69      1.1.2 质粒与菌株  69-70      1.1.3 PCR引物  70      1.1.4 培养基及试剂的配制  70    1.2 方法  70-73      1.2.1 枯草芽孢杆菌重组工程菌的构建  70-72      1.2.2 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备  72      1.2.3 枯草芽孢杆菌的电转化  72      1.2.4 阳性重组子的鉴定  72-73      1.2.5 重组质粒在枯草芽孢杆菌中的诱导表达  73      1.2.6 重组脂肪酶活性的检测及SDS-PAGE分析  73      1.2.7 重组脂肪酶的酶学性质  73  2 结果与分析  73-79    2.1 枯草芽孢杆菌重组工程菌的构建  73-74    2.2 pHT43-lip3的电击转化及阳性转化子的鉴定  74    2.3 重组质粒在枯草芽孢杆菌中的诱导表达及产物检测、SDS-PAGE分析  74-75    2.4 重组脂肪酶的酶学性质  75-78      2.4.1 重组脂肪酶的有机溶剂耐性  75-76      2.4.2 重组脂肪酶的最适温度及温度稳定性  76-77      2.4.3 重组脂肪酶的最适pH及pH稳定性  77      2.4.4 金属离子对重组脂肪酶酶活的影响  77-78    2.5 重组脂肪酶pHT43-lip3与pET-lip3酶学性质的比较  78-79  3 讨论  79  4 小结  79-80第五章 脂肪酶基因lip5的定点突变  80-88  1 材料和方法  80-83    1.1 材料  80-81      1.1.1 主要仪器  80      1.1.2 菌株与载体  80      1.1.3 PCR引物  80-81      1.1.4 培养基及试剂的配制  81    1.2 方法  81-83      1.2.1 lip5的定点突变  81-82      1.2.2 枯草芽孢杆菌重组工程菌的构建  82      1.2.3 阳性重组子的鉴定  82      1.2.4 重组质粒在枯草芽孢杆菌中的诱导表达  82      1.2.5 重组脂肪酶的SDS-PAGE分析  82      1.2.6 重组脂肪酶的酶学性质  82-83  2 结果与分析  83-87    2.1 lip5的定点突变  83-84      2.1.1 突变基因的获得:第一、二轮PCR  83      2.1.2 突变基因的获得:第三轮PCR  83-84    2.2 枯草芽孢杆菌重组工程菌的构建及阳性重组子的鉴定  84    2.3 重组质粒在枯草芽孢杆菌中的转化、表达及重组脂肪酶活性的检测  84-85    2.4 重组脂肪酶的酶学性质  85-86      2.4.1 重组脂肪酶的有机溶剂耐性  85      2.4.2 重组脂肪酶的最适温度及温度耐性  85-86      2.4.3 重组脂肪酶的最适pH及pH耐性  86    2.5 重组脂肪酶酶pHT43-lip3与pHT43-lip5_(D93s)酶学性质的比较  86-87  3 讨论  87  4 小结  87-88全文总结  88-90参考文献  90-96致谢  96-98攻读硕士期间发表及投稿论文情况  98

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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