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基于转录组的枯草杆菌响应细胞外信号机制研究

作　者: 俞文榜
导　师: 叶邦策
学　校: 华东理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 转录组信号传导枯草杆菌发酵溶氧抗生素作用机制耐药性
分类号: Q936
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

为了生存,微生物总是每时每刻都在感知细胞外环境和内环境的信号。当环境中某些因素改变时,微生物就能通过信号传导机制,快速调整自身的基因表达或者代谢状态,从而适应环境变化。对微生物自身而言,它们的这种能力使其能适应复杂环境,使它们的种族能不断延续。对人类来说,研究微生物的信号传导机制也有重要意义。例如,在利用微生物进行的发酵过程中,改变过程中一些参数(营养成分,培养条件)会引起产物产量显著变化；在疾病治疗中,人们发现一些外在因素,如药物、营养成分会引起致病菌耐药能力的改变。这些都是环境变化导致微生物生理状态改变引起的。本论文采用基因芯片技术,以枯草杆菌(Bacillus subtilis)为例,对微生物如何根据环境变化改变自身生理状态进行了研究。本文的主要研究内容如下。(1)溶氧是枯草杆菌腺苷发酵过程中的重要因素。前期实验发现较低溶氧水平有利于腺苷积累。为了解释供氧水平与腺苷生产之间的关系,我们用转录组学方法系统地分析了供氧对枯草杆菌基因表达和代谢的影响。实验中使用了包含4106个基因的芯片,比较了较高供氧水平(700rpm)和较低供氧水平(450rpm)下枯草杆菌的表达谱。转录组信息分析表明溶氧对枯草杆菌代谢途径的影响主要表现为三个方面：一,低溶氧加强了枯草杆菌的碳代谢,包括葡萄糖的利用、丙酮酸的利用和碳溢流途径；二,低溶氧抑制了枯草杆菌的氮代谢途径,包括谷氨酸降解、黄嘌呤的降解以及嘌呤的合成；三,低溶氧加强了枯草杆菌的呼吸、蛋白质合成和芽孢形成。根据这些信息,我们提出了溶氧信号在枯草杆菌中的信号通路,初步解释了溶氧影响腺苷产量的机理。根据所提出的机制,优化了腺苷发酵过程,使腺苷产量提高了30%。我们的研究为溶氧与微生物代谢的关系提供了新的认识。(2) Fusaricidins (Fus)是一种新型脂环肽抗生素,对多种革兰氏阳性菌具有很好的抑菌效果。然而我们的实验发现,当作用于枯草杆菌时,Fus抗菌肽只能短暂抑制枯草杆菌的生长(这时有大量细菌裂解)。在Fus抗菌肽作用几个小时后,枯草杆菌就会重新生长(回复生长)。我们通过分析枯草杆菌响应Fus抗菌肽的不同时间点(5分钟及2小时)转录组变化,研究这种现象发生的机制。结果表明Fus抗菌肽首先会破坏细胞膜并诱导大量细胞膜保护基因(主要是SigW调控基因)。而在回复生长时,枯草杆菌对Fus抗菌肽产生了耐药性并在代谢和细胞行为上发生了明显变化：一,枯草杆菌对碳源和铁的需求增加；二,大量运动和趋化相关基因高表达,并且伴随有大量的鞭毛产生；三,枯草杆菌呈现出聚集生长。实验结果也发现,枯草杆菌铁代谢与抗菌肽作用机制及耐药性有紧密联系。这项研究为进一步揭示脂环肽抗生素的作用机制及耐药性提供了新的线索。(3)重金属离子是微生物生存必须的元素,但又具有细胞毒性。在一些重金属离子污染严重的水域中,人们发现这些离子会引起微生物对一些抗生素的抗药性。我们的研究发现,细胞外高浓度Fe3+能专一性地增加枯草杆菌对脂环肽的耐药性。我们用基因芯片研究了高浓度Fe3+对枯草杆菌代谢、信号传导以及细胞结构的影响。转录组数据分析表明：高浓度Fe3+对枯草杆菌的细胞膜蛋白、细胞膜的脂肪酸组成、细胞壁结构以及碳、氮、磷等代谢均有所影响。最终我们发现Fe3+之所以能增加枯草杆菌对脂环肽的抗性,是因为它能维持枯草杆菌的质子驱动势(Proton Motive Force:PMF)通过保持PMF, Fe3+可以抑制枯草杆菌的裂解,从而增加其抗药性。这项研究为重金属离子引起微生物抗药性的机理增加了新的认识。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-13
第1章绪论  13-33
  1.1 枯草杆菌信号传导机制简介  15-20
    1.1.1 枯草杆菌的细胞外信号传导机制  16-19
    1.1.2 枯草杆菌细胞内信号传导机制  19-20
  1.2 枯草杆菌的应急反应  20-23
    1.2.1 枯草杆菌的特定应急反应  20-22
    1.2.2 枯草杆菌的通用应急反应  22-23
  1.3 枯草杆菌的内平衡  23-29
    1.3.1 枯草杆菌的碳氮平衡  24-26
    1.3.2 枯草杆菌的氧化还原平衡  26-27
    1.3.3 枯草杆菌的金属离子平衡  27-29
  1.4 转录组简介  29-30
  1.5 本论文的研究目的、研究内容及意义  30-33
    1.5.1 溶氧控制在发酵中的重要性  30-31
    1.5.2 抗菌肽与微生物耐药性  31-32
    1.5.3 本研究的主要内容及意义  32-33
第2章枯草杆菌腺苷发酵过程中溶氧与代谢的关系研究  33-57
  2.1 引言  33
  2.2 实验原理  33-34
  2.3 实验材料  34-36
    2.3.1 实验菌种  34
    2.3.2 实验材料  34-35
    2.3.3 所用仪器  35-36
    2.3.4 培养基配方  36
  2.4 实验方法  36-38
    2.4.1 培养方法  36
    2.4.2 菌浓测定  36
    2.4.3 葡萄糖含量测定  36
    2.4.4 高效液相色谱法测量有机酸、核苷酸和氨基酸  36-37
    2.4.5 枯草杆菌总RNA抽提  37
    2.4.6 芯片实验  37-38
  2.5 结果与讨论  38-56
    2.5.1 溶氧条件与腺苷产量的关系  38
    2.5.2 12h和18h的差异基因  38-39
    2.5.3 差异基因的功能富集  39-40
    2.5.4 T-Profiler分析  40-45
    2.5.5 碳代谢  45-47
    2.5.6 氨基酸代谢  47-50
    2.5.7 嘌呤核苷酸代谢  50-52
    2.5.8 辅酶合成  52-53
    2.5.9 呼吸  53-54
    2.5.10 芽孢生产  54
    2.5.11 溶氧控制枯草杆菌代谢流的内在机制  54-55
    2.5.12 腺苷发酵的优化  55-56
  2.6 本章小结  56-57
第3章脂环肽抗生素Fusaricidins对枯草杆菌的作用机制研究  57-79
  3.1 引言  57-58
  3.2 实验原理  58
  3.3 实验材料  58-60
    3.3.1 实验菌株  58-59
    3.3.2 实验试剂  59
    3.3.3 所用仪器  59-60
  3.4 实验方法  60-61
    3.4.1 培养方法  60
    3.4.2 菌浓测定  60
    3.4.3 细胞膜破损度测定方法  60
    3.4.4 透射电镜观察  60-61
    3.4.5 枯草杆菌总RNA抽提  61
    3.4.6 芯片实验  61
  3.5 结果与讨论  61-77
    3.5.1 Fus对枯草杆菌的作用特点  61-63
    3.5.2 枯草杆菌对Fus的前期转录组响应  63-64
    3.5.3 枯草杆菌对Fus的后期转录组响应  64-65
    3.5.4 T-Profiler分析  65-69
    3.5.5 碳代谢  69-71
    3.5.6 铁代谢  71-72
    3.5.7 细胞膜相关基因和解毒蛋白分析  72-74
    3.5.8 铁对枯草杆菌耐药性的影响  74-76
    3.5.9 与其他具有抗药性的枯草杆菌的比较  76-77
  3.6 本章小结  77-79
第4章高浓度Fe~(3+)环境中枯草杆菌产生耐药性的原因  79-104
  4.1 引言  79-80
  4.2 实验原理  80
  4.3 实验材料  80-83
    4.3.1 实验菌株  80-81
    4.3.2 实验试剂  81-82
    4.3.3 所用仪器  82-83
  4.4 实验方法  83-85
    4.4.1 培养方法  83
    4.4.2 菌浓测定  83
    4.4.3 存活率检测实验  83
    4.4.4 枯草杆菌总RNA抽提  83
    4.4.5 片实验  83-84
    4.4.6 细胞膜流动性检测实验  84
    4.4.7 脂肪酸分析实验及荧光定量PCR实验  84-85
    4.4.8 PMF分析实验  85
  4.5 结果与讨论  85-102
    4.5.1 高浓度铁离子加强枯草杆菌对脂环肽的抗药性  85-87
    4.5.2 片分析  87-88
    4.5.3 T-Profiler分析  88-92
    4.5.4 细胞膜相关基因  92-96
    4.5.5 代谢途径  96-98
    4.5.6 Fe~(3+)能维持PMF抑制细菌裂解  98-100
    4.5.7 可氧化碳源对Pol引起的细菌裂解的抑制  100-102
    4.5.8 Fe~(3+)维持PMF的机制研究  102
  4.6 本章小结  102-104
第5章总结与展望  104-106
  5.1 总结与创新  104
  5.2 展望  104-106
参考文献  106-120
附录1  120-173
附录2  173-174
致谢  174-175

基于转录组的枯草杆菌响应细胞外信号机制研究

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