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米曲霉FS-1脂肪酶发酵优化、分离纯化与酶学特性的研究

作　者: 邓琳芬
导　师: 郑毅
学　校: 福建师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 米曲霉脂肪酶发酵优化分离纯化酶学特性
分类号: TQ925.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

对米曲霉FS-1产脂肪酶进行发酵优化。首先通过单因素实验,确定发酵最适碳源为玉米粉,氮源为蛋白胨。然后通过Plackett-Burman试验设计对培养基中的8个成分进行筛选,得到对影响产酶结果最显著的3个培养基成分是蛋白胨、橄榄油和Na2HPO4。通过Box-Behnken中心组合设计对以上3个显著成分进行优化,获得三成分的最佳组合。优化后的最适培养基配方为(g/L)：玉米粉0.5,蛋白胨50,橄榄油15, NaNO3 10, Na2HPO4 2.5, KC1 0.5, MgSO4 0.5, FeSO4 0.01。发酵条件优化获得最适条件：接种量2%,装液量20m1/250mL三角瓶,发酵温度为28℃,发酵初始pH为8.0,发酵时间为48h。产酶水平从初始的3.25U/mL提高到18.75U/mLFS-1脂肪酶的分离纯化。收集发酵液上清,上清分别经过60%硫酸铵沉淀、透析除盐、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析等纯化步骤,纯化后的酶的比活力为287.81U/mg、纯化倍数为9.21、回收率为26.39%,SDS-PAGE电泳测定蛋白质纯度,电泳图谱为单一条带,表明纯化得到较纯蛋白样品。FS-1脂肪酶理化性质的测定。该酶分子量为40.64 kDa。最适酶促反应温度为36℃C,40℃以内酶的热稳定性好。最适酶促反应pH值为7.0,在pH值为3.0-9.0的范围内相对稳定。以橄榄油、三丁酸甘油酯为底物分别进行酶的动力学研究,结果表明,两者的酶促反应都符合米氏方程,最大反应初速度Vm分别为23.70 umol/mL/min,24.33μmol/mL/min,米氏常数Km分别为48.44μmol/mL、20.43μmol/mL,反应活化能(Ea)分别为41.78 kJ/mol、31.68 kJ/mol。不同效应物对FS-1脂肪酶活力的影响。(1)金属离子对酶活力的影响：一价金属离子Na+、K+、Li+以及二价金属离子Ba2+对酶促反应无影响。Ca2+对酶活力有促进作用；二价金属离子Mg2+、Cu2+、Fe2+、Hg2+以及三价金属离子Fe3+、A13+对酶活都有不同程度的抑制作用。(2)有机溶剂对酶活力的影响：甲醇、乙醇、甲醛、异丙醇对酶均有不同程度的抑制作用；甲醛对酶抑制作用最强烈；正戊烷对酶活力没影响。(3)不同化学修饰剂对酶活力的影响：顺丁烯二酸酐、溴乙酸、N-乙酰咪唑、β-巯基乙醇、乙酰丙酮、氯胺-T、N-溴代丁二酰亚胺、苯甲基磺酸钠(PMSF)这8种修饰剂中,只有β-巯基乙醇和苯甲基磺酸钠对酶产生影响,初步判断甲硫氨酸、丝氨酸残基与酶的催化活性密切相关。

全文目录

中文摘要 2-4Abstract 4-6中文文摘 6-14绪论 14-26 1 脂肪酶的定义及结构 14 2 脂肪酶的来源及种类 14 3 微生物脂肪酶的发酵研究 14-16 3.1 发酵培养基研究 15 3.2 发酵条件研究 15-16 3.3 发酵培养方式研究 16 4 脂肪酶的分离纯化 16-18 5 脂肪酶的酶学性质的研究 18-21 5.1 脂肪酶最适作用温度及热稳定性 18 5.2 脂肪酶最适作用pH及pH稳定性 18-19 5.3 金属离子和螯合剂对脂肪酶活性的影响 19 5.4 有机溶剂对脂肪酶活性的影响 19-20 5.5 脂肪酶的活性部位及化学修饰 20 5.6 脂肪酶的底物特异性 20-21 6 脂肪酶的酶活测定方法 21-22 6.1 滴定法 21 6.2 平板法 21 6.3 对硝基苯酚法 21-22 7 脂肪酶的应用 22-24 7.1 脂肪酶在食品加工中的应用 22 7.2 脂肪酶在纺织中的应用 22 7.3 脂肪酶在医学上的应用 22-23 7.4 脂肪酶在洗涤业中的应用 23 7.5 脂肪酶在油脂水解中的应用 23 7.6 脂肪酶在皮革生产中的应用 23-24 7.7 脂肪酶在纸浆和造纸业中的应用 24 8 米曲霉脂肪酶的研究概述 24 9 选题依据和意义 24-25 10 研究内容 25-26第1章米曲霉脂肪酶的发酵优化 26-42 1 材料 26-27 1.1 菌种 26 1.2 药品与试剂 26 1.2.1 常用药品 26 1.2.2 常用缓冲液 26 1.3 培养基 26-27 1.4 主要仪器 27 2 方法 27-29 2.1 脂肪酶酶活测定方法 27 2.2 发酵培养方法 27 2.3 发酵培养基优化 27-28 2.3.1 单因素优化 27-28 2.3.2 Plackett-Burman实验优化 28 2.3.3 响应面优化 28 2.4 发酵条件优化 28-29 2.4.1 接种量对产酶的影响 28 2.4.2 装液量对产酶的影响 28 2.4.3 温度对产酶的影响 #15. 28 2.4.4 发酵初始pH对产酶的影响 28-29 2.4.5 发酵时间对产酶的影响 29 3 结果与分析 29-40 3.1 单因素优化 29-30 3.2 Plackett-Burman实验设计筛选重要因子 30-31 3.3 培养基显著因子单因素优化 31-33 3.3.1 蛋白胨对产酶的影响 31-32 3.3.2 橄榄油对产酶的影响 32 3.3.3 Na_2HPO_4对产酶影响 32-33 3.4 响应面试验设计与结果 33-37 3.4.1 Box-Behnken设计与结果 33-34 3.4.2 二次响应面回归模型的建立 34-37 3.4.3 发酵优化最佳配方的确定及实验验证 37 3.5 发酵条件优化 37-40 3.5.1 接种量对产酶的影响 37-38 3.5.2 装液量对产酶的影响 38 3.5.3 发酵温度对产酶的影响 38-39 3.5.4 发酵初始pH对产酶的影响 39 3.5.5 发酵时间对产酶的影响 39-40 4 小结 40-42第2章脂肪酶的分离纯化 42-52 1 材料 42-43 1.1 酶液 42 1.2 药品与试剂 42-43 1.3 仪器 43 2 方法 43-48 2.1 脂肪酶的酶活测定 44 2.2 脂肪酶的分离纯化方法 44-46 2.2.1 脂肪酶的分离纯化技术路线 44 2.2.2 脂肪酶的分离纯化步骤 44-46 2.3 脂肪酶的免疫印迹 46-48 3 结果与分析 48-51 3.1 硫酸铵沉淀 48 3.2 离子交换层析柱小体系pH试验 48-49 3.3 DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析 49-50 3.4 脂肪酶纯度的鉴定 50 3.5 分离纯化结果汇总 50-51 3.6 酶的蛋白印迹 51 4 讨论与小结 51-52第3章脂肪酶的理化性质及催化动力学研究 52-66 1 材料 52-53 1.1 酶液 52 1.2 药品与试剂 52 1.3 仪器 52-53 2 方法 53-54 2.1 脂肪酶酶活测定方法 53 2.2 脂肪酶分子量的测定 53 2.3 温度对酶活的影响 53 2.4 酶的热稳定性 53 2.5 pH值对酶活的影响 53 2.6 酶的酸碱稳定性 53-54 2.7 酶催化反应的动力学性质研究 54 2.7.1 酶促反应动力学 54 2.7.2 酶促反应的活化能 54 3 结果与分析 54-63 3.1 脂肪酶分子量的测定 54-55 3.2 酶的最适反应温度 55-56 3.3 酶的温度稳定性 56 3.4 酶的最适反应pH 56-57 3.5 酶的酸碱稳定性 57 3.6 酶的动力学研究 57-63 3.6.1 酶促反应常数 58-60 3.6.2 酶促反应的活化能 60-63 4 讨论与小结 63-66第4章不同效应物对脂肪酶活力的影响 66-74 1 材料 66-67 1.1 酶液 66 1.2 药品 66-67 1.3 仪器 67 2 方法 67-68 2.1 脂肪酶的酶活测定方法 67 2.2 金属离子对酶活力的影响 67 2.3 有机溶剂对酶活力的影响 67 2.4 化学修饰剂对酶活力的影响 67-68 3 结果与分析 68-71 3.1 金属离子对酶活力的影响 68-69 3.1.1 正一价金属离子对酶活力的影响 68 3.1.2 正二价金属离子对酶活力的影响 68-69 3.1.3 正三价金属离子对酶活力的影响 69 3.2 有机溶剂对酶活力的影响 69-70 3.3 化学修饰剂对酶活力的影响 70-71 4 讨论与小结 71-74第5章结论与展望 74-78 1 结论 74-75 1.1 米曲霉脂肪酶发酵优化结果 74 1.2 酶的分离纯化 74 1.3 酶学特性及动力学研究 74-75 1.4 几种效应物对酶活力的影响 75 2 展望 75-78参考文献 78-86攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 86-88致谢 88-90个人简历 90-91

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