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淀粉液化芽孢杆菌ES-2抗菌脂肽生产工艺的研究

作　者: 魏浩
导　师: 别小妹
学　校: 南京农业大学
专　业: 食品科学
关键词: 抗菌脂肽消泡剂大孔树脂溶氧
分类号: TQ936.16
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

抗菌脂肽是芽孢杆菌属产生的微生物来源的抗菌肽,具有抗细菌、真菌、病毒和支原体的功能。由于抗菌脂肽高效、无毒,使得在生物医药方面具有重要的应用价值。此外,脂肽作为一种生物表面活性剂在石油工业、食品、化妆品和农业上有着广泛的应用价值。近几年来,本实验室筛选到一株植物内生菌菌株Bacillus amyloliquefaciens ES-2,该菌株产生的抗微生物活性物质具有良好的热稳定性和部分酶稳定性,抗菌谱广,抗微生物活性高。前期研究表明该微生物活性物质主要为surfactin和fengycin,均为环状脂肽。为了实现抗菌脂肽的工业化,急需解决发酵过程中产生的泡沫问题以及确定简单可行的生产工艺。因此本研究从消泡剂出发,研究消泡剂消泡的可能性,同时研究提取纯化抗菌脂肽的方法,最后对溶氧对发酵的影响进行了初步的研究,得出以下研究结果：1.将大豆油、有机硅消泡剂和聚醚类消泡剂三种消泡剂分别用于Bacillus amyloliquefaciens ES-2抗菌脂肽发酵,研究表明三种消泡剂均可以实现消泡和抑泡,其中大豆油和有机硅消泡剂表现出更好的消泡性能和抑泡性能。以大豆油和聚醚类消泡剂为消泡剂的发酵液的菌体含量高于不添加消泡剂的发酵液.。其中以聚醚为消泡剂的发酵液的菌体干重增大的最多,发酵24h时其菌体干重为对照的2.14倍。以大豆油和聚醚类消泡剂为消泡剂的发酵液中抗菌脂肽的含量相对于不加消泡剂下的发酵有了很大的提高,其中大豆油带来的产量的增加尤其明显,脂肽达到了2497.67mg/L。2.在抗菌脂肽的提取中,大豆油的加入有利于抗菌脂肽的酸沉提取,酸沉提取率达到了92.29%。以大豆油为消泡剂的发酵得到的抗菌脂肽更容易使用甲醇和乙醇提取出来,提取率达到了很高水平,并且其产品纯度也略高于不加消泡剂发酵提取到的抗菌脂肽产品纯度,因此可以确定大豆油为适合抗菌脂肽发酵的消泡剂。选择硅藻土过滤的方法获得酸沉后的絮凝物,并选择乙醇对做有机溶剂提取,乙醇用量跟发酵液总量的体积比为1：2.5时抗菌脂肽提取率达到了88.72%。3.对抗菌脂肽粗提物进行了大孔树脂吸附纯化研究,结果表明X-5大孔树脂在静态吸附中表现出优秀的对抗菌脂肽的吸附能力,吸附量达到了57.73 mg.g-1,吸附率达到了85.05%,在解吸结果中,解析率达到了65.59%,综合吸附和解吸效果,选择X-5大孔树脂作为研究吸附纯化的材料。经过动态吸附初步研究结果表明经过吸附纯化抗菌脂肽纯度达到了72.86%,相对原粗提物的纯度有了较大的提高,因此可以选择大孔树脂吸附作为提高抗菌脂肽纯度的方法。纯化采用100%乙醇洗脱,纯化的工艺参数为：上样浓度14.4mg/mL、上样速率1 mL/min,洗脱速率2 mL/min、洗脱剂用量2.5BV,产品的回收率达90.01%,纯度达74.4%。4.试验通过溶氧电极观察记录发酵过程中的溶氧变化,结果显示发酵6h后溶氧开始下降,并且下降幅度逐渐增大,到18h时溶氧为0.6%,溶氧达到了一个非常低的水平,并维持此低溶氧水平至发酵结束。为研究溶氧对发酵的影响,采用三种溶氧控制方案对抗菌脂肽的发酵进行控制,经过检测发现在发酵全过程保持溶氧水平在5%以上时,菌体浓度、细胞比生长速率和细胞生产强度均得到了提高,但是抗菌脂肽产量、产物比合成速率和产物生产强度均下降。在发酵后期即菌体生长进入稳定期后提高溶氧水平在5%以上时,菌体生长相对正常发酵没有变化,而抗菌脂肽产量、产物比合成速率和产物生产强度均上升。因此可以说明溶氧在抗菌脂肽发酵过程中是调整菌体生长和产物合成代谢的重要因素。

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摘要 13-15ABSTRACT 15-18第一章文献综述 18-36 1 抗菌脂肽的研究 18-27 1.1 抗菌脂肽的结构和生物活性 18-20 1.1.1 表面活性素(surfactin) 18-19 1.1.2 芬荠素(fengycin) 19 1.1.3 伊枯草菌素(iturin) 19-20 1.1.4 制磷脂菌素(plipstatin) 20 1.2 抗菌脂肽的发酵生产 20-21 1.3 抗菌脂肽发酵消泡的研究 21-23 1.3.1 泡沫的形成及所带来的危害 21-22 1.3.2 消泡与消泡剂 22 1.3.3 抗菌脂肽发酵消泡的研究 22-23 1.4 抗菌脂肽的提取及纯化 23-25 1.4.1 抗菌脂肽的提取 23-24 1.4.2 抗菌脂肽的纯化 24-25 1.5 抗菌脂肽的应用 25-27 1.5.1 食品工业 25-26 1.5.2 医药行业 26 1.5.3 农业生物防治 26 1.5.4 环境保护 26-27 2 展望 27 3 本研究的目的意义及内容 27-28 参考文献 28-36第二章 Bacillus amyloliquefaciens ES-2发酵产抗菌脂肽的消泡研究 36-48 1 材料与方法 36-40 1.1 材料 36-38 1.1.1 菌种 36-37 1.1.2 主要仪器和设备 37 1.1.3 培养基 37 1.1.4 试剂与材料 37-38 1.2 方法 38-40 1.2.1 Bacillus amyloliquefaciens ES-2的培养方法 38 1.2.2 消泡剂消泡能力和抑泡能力的比较 38-39 1.2.3 消泡剂的使用量的测定方法 39 1.2.4 抗菌脂肽产量的测定方法 39-40 1.2.5 菌体干重的测定方法 40 1.2.6 发酵液抑菌效果的测定方法 40 2 结果与分析 40-44 2.1 不同消泡剂的消泡能力和抑泡能力的比较 40-41 2.1.1 消泡剂消泡能力的研究结果 40-41 2.1.2 消泡剂抑泡能力的研究结果 41 2.2 消泡剂使用量的初步测定 41-42 2.3 消泡剂对抗菌脂肽发酵产生的影响 42-44 2.3.1 消泡剂对菌体生长的影响 42-43 2.3.2 消泡剂对抗菌脂肽产量的影响 43 2.3.3 不同消泡剂处理的发酵液的抑菌效果比较 43-44 3 讨论 44-45 4 本章小结 45-46 参考文献 46-48第三章 Bacillus amyloliquefaciens ES-2产抗菌脂肽提取工艺的研究 48-60 1 材料与方法 48-51 1.1 材料 48-49 1.1.1 菌种 48 1.1.2 主要仪器和设备 48-49 1.1.3 培养基 49 1.1.4 试剂 49 1.2 方法 49-51 1.2.1 Bacillus amyloliquefaciens ES-2培养方法 49 1.2.2 酸沉方法及其提取率计算方法 49-50 1.2.3 甲醇、乙醇提取抗菌脂肽的方法 50 1.2.4 醇提取抗菌脂肽用量的方法 50 1.2.5 抗菌脂肽含量的检测方法 50-51 1.2.6 抗菌脂肽产品纯度的检测方法 51 2 结果与分析 51-57 2.1 发酵液酸沉处理 51-52 2.1.1 酸沉效果 51 2.1.2 不同消泡剂酸沉过程中抗菌脂肽的提取率比较 51-52 2.2 有机溶剂提取抗菌脂肽 52-55 2.2.1 甲醇提取抗菌脂肽的研究结果 52-54 2.2.2 醇提取抗菌脂肽的研究结果 54-55 2.3 以大豆油为消泡剂抗菌脂肽的提取 55-57 2.3.1 硅藻土过滤的效果比较 55-56 2.3.2 醇提取抗菌脂肽用量 56-57 3 讨论 57 4 本章小结 57-58 参考文献 58-60第四章 Bacillus amyloliquefaciens ES-2产抗菌脂肽提纯工艺的研究 60-74 1 材料与方法 60-65 1.1 材料 60-62 1.1.1 菌种 60 1.1.2 主要仪器和设备 60-61 1.1.3 培养基 61 1.1.4 试剂与材料 61-62 1.2 方法 62-65 1.2.1 抗菌脂肽粗提取样品制备方法 62 1.2.2 大孔树脂的选择及预处理方法 62 1.2.3 大孔树脂的装柱 62 1.2.4 大孔树脂的静态吸附与解吸 62-64 1.2.5 大孔树脂的动态吸附与解吸 64 1.2.6 抗菌脂肽含量的检测方法 64-65 2 结果与分析 65-70 2.1 大孔树脂静态吸附与解吸的测定与分析 65-68 2.1.1 大孔树脂吸附量与吸附率的测定与分析 65-66 2.1.2 大孔树脂的解吸附率测定结果与分析 66 2.1.3 大孔树脂X-5浓度的确定 66-67 2.1.4 不同浓度的乙醇对大孔树脂解吸附的影响 67-68 2.2 大孔树脂动态吸附与解吸 68-70 2.2.1 大孔树脂动态吸附特征观察 68 2.2.2 上样速率对吸附率的影响 68-69 2.2.3 上样浓度对吸附率的影响 69-70 2.2.4 洗脱速率对解析率的影响 70 3 讨论 70-71 4 本章小结 71-72 参考文献 72-74第五章溶氧控制对Bacillus amyloliquefaciens ES-2产抗菌脂肽发酵的影响 74-86 1 材料与方法 74-77 1.1 材料 74-75 1.1.1 菌种 74 1.1.2 主要仪器和设备 74-75 1.1.3 培养基 75 1.1.4 试剂 75 1.2 方法 75-77 1.2.1 培养方法 75-76 1.2.2 菌体干重的测定方法 76 1.2.3 参数计算公式 76 1.2.4 溶氧控制试验设计 76 1.2.5 抗菌脂肽产量的测定方法 76-77 2 结果与分析 77-83 2.1 抗菌脂肽发酵过程中溶氧的变化 77-79 2.2 溶氧控制对菌体生长的影响 79-81 2.2.1 不同发酵条件下的细胞生长变化 79 2.2.2 不同发酵条件下的细胞比生长速率μ 79-80 2.2.3 不同发酵条件下的细胞生产强度 80-81 2.3 控制溶氧对产物合成的影响 81-83 2.3.1 不同发酵条件下抗菌脂肽的产量 81 2.3.2 不同发酵条件下的产物比合成速率q_p 81-82 2.3.3 发酵条件下的产物生产强度 82-83 2.3.4 同发酵条件下消泡剂的用量 83 3 讨论 83-84 4 本章小结 84-85 参考文献 85-86全文总结 86-88论文创新点 88-90研究生期间发表的研究论文 90-92致谢 92

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