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WSSV和干露胁迫条件下脊尾白虾（Exopalamoncarin cauda）ferritin基因及热休克蛋白70基因表达特征

作　者: 李美玉
导　师: 李健
学　校: 上海海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: 脊尾白虾铁蛋白热休克蛋白70 克隆表达 WSSV 干露胁迫
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

铁蛋白ferritin基因是机体生长及免疫相关的重要功能基因，它具有调节铁代谢平衡、抗氧化细胞保护以及肿瘤免疫治疗等多种复杂的生物学功能，铁蛋白的研究已成为当前生命科学领域研究的热点之一。热休克蛋白70是热休克蛋白家族中的重要成员，是甲壳动物最重要的应激蛋白之一。目前，关于铁蛋白和热休克蛋白70的研究主要集中在脊椎动物上，而对于无脊椎动物，尤其是甲壳动物的铁蛋白的研究相对较少。本实验以脊尾白虾为实验材料，克隆了脊尾白虾ferritin基因，进行了WSSV感染对ferritin基因表达分析，完成了干露胁迫对脊尾白虾成活率、ferritin基因及热休克蛋白70的表达影响，旨在认知脊尾白虾免疫特点和环境胁迫下脊尾白虾的应激反应。研究分为两部分：第一部分是以脊尾白虾为研究对象，利用RT-PCR以及RACE技术获得了总长度为755bp的脊尾白虾(Exopalamon carincauda) ferritin基因cDNA序列。该基因序列5′和3′的非编码区分别为112bp和146bp，开放阅读框497bp，推测编码169个氨基酸。预测蛋白分子量19.1kDa，等电点5.46，5′-非编码区有一个铁反应元件（iron response element，IRE），该基因命名为Ecfer基因。氨基酸序列比对发现与其他甲壳动物铁蛋白氨基酸序列同源性在64%-67%，与脊椎动物铁蛋白H链氨基酸序列同源性在53%-57%。利用Neighbor-joining构建系统进化树分析结果表明Ecfer基因氨基酸序列与无脊椎动物中的甲壳动物聚为一支。运用荧光定量RT-PCR研究分析Ecfer基因在组织中表达分布,以及经WSSV感染后血淋巴、肝胰腺中的表达变化情况。实验结果表明Ecfer在肝胰腺、卵巢、肌肉、鳃和血淋巴中均有分布，在肝胰腺中表达量最高，卵巢中表达量最低。注射WSSV后3h和6h,脊尾白虾肝胰腺和血淋巴铁蛋白基因表达较对照组都有显著上调（P<0.05），并具有显著的时间差异性。说明WSSV感染可显著上调Ecfer基因的表达，提示了Ecfer基因可能参与了脊尾白虾抵抗WSSV入侵的免疫反应,血淋巴在WSSV感染中表现得比肝脏更敏感。第二部分以脊尾白虾为实验动物，以C组（干燥低温）、CG组（干燥常温）、P组（湿润低温）和PG组（湿润常温）四个实验组和一个对照组D组进行为期12h的干露胁迫实验，记录12h各实验组成活率。应用实时定量PCR方法研究了不同干露胁迫条件对脊尾白虾血淋巴、肝胰腺及肌肉中ferritin基因和HSP70基因表达的影响。结果表明：（1）保持虾体湿润并用冰块降温的P组干露胁迫12h后成活率为75%，显著高于其他各实验组（P<0.05）。（2）干露胁迫能上调P组脊尾白虾血淋巴、肝胰腺和肌肉ferritin基因的表达，显著高于对照组（P<0.05），并且各组织ferritin基因表达的上调时间具有差异性，血淋巴最先上调。干露胁迫对C组、CG组和PG组脊尾白虾各组织ferritin基因表达具有下调作用，并显著低于对照组（P<0.05）。（3）干露胁迫能诱导脊尾白虾血淋巴、肝胰腺和肌肉HSP70基因的表达水平，显著高于对照组（P<0.05）。各组织hsp70基因表达的上调时间具有差异性，肝胰腺最先上调。C组、CG组和PG组在1.5h出现大幅度上调，显著高于P组（P<0.05），P组上调缓慢。这些结果表明：保持虾体湿润低温可显著提高干露胁迫12h后脊尾白虾的成活率，干露胁迫与ferritin基因和Hsp70基因有直接影响。在干露胁迫在耐受范围内，ferritin基因和Hsp70发挥抗氧化功能。

全文目录

摘要  2-5
Abstract  5-10
第一章综述  10-21
  1.1 脊尾白虾养殖产业的发展现状  10-11
    1.1.1 脊尾白虾分类地位及生物学性状  10-11
    1.1.2 脊尾白虾养殖发展现状  11
  1.2 甲壳动物的免疫系统  11-14
    1.2.1 体液免疫  12-13
    1.2.2 细胞免疫  13-14
  1.3 铁蛋白  14-17
    1.3.1 铁蛋白的结构  14-15
    1.3.2 铁蛋白（ferritin）分类  15-16
    1.3.3 铁蛋白的功能  16-17
  1.4 环境因素与甲壳动物的关系  17-18
  1.5 热休克蛋白 70  18-19
    1.5.1 热休克蛋白 70 的结构  18
    1.5.2 热休克蛋白 70 的功能  18-19
  1.6 展望  19-21
第二章脊尾白虾（Exopalamon carincauda）ferritin 基因克隆及表达分析  21-42
  2.1 材料与方法  22-31
    2.1.1 试剂  22
    2.1.2 实验仪器  22
    2.1.3 方法  22-31
  2.2 结果  31-39
    2.2.1 脊尾白虾总 RNA 提取  31
    2.2.2 脊尾白虾 ferritin 基因中间片段 cDNA 的克隆  31-32
    2.2.3 Ecfer 基因全长 cDNA 序列分析  32-35
    2.2.4 Ecfer 基因多序列比对及系统进化树分析  35-37
    2.2.5 Ecfer基因在脊尾白虾各组织中的表达分布及WSSV对其肝胰腺、血淋巴中表达变化量的影响  37-39
  2.3 讨论  39-42
第三章 ferritin 基因和热休克蛋白 70 在脊尾白虾抗干露胁迫中的作用  42-52
  3.1 材料与方法  43-45
    3.1.1 药品试剂及实验仪器  43
    3.1.2 方法  43-45
  3.2 结果  45-49
    3.2.1 脊尾白虾不同离水干露条件下 12h 的存活率  45-46
    3.2.2 干露胁迫对脊尾白虾 ferritin 基因表达的影响  46-49
  3.3 讨论  49-52
    3.3.1 干露刺激对脊尾白虾成活率的影响  49
    3.3.2 干露胁迫对脊尾白虾 ferritin 基因表达的影响  49-50
    3.3.3 干露胁迫对脊尾白虾 HSP70 基因表达的影响  50-52
结论  52-54
参考文献  54-62
硕士在读期间论文发表情况及课题资助  62-63
致谢  63

WSSV和干露胁迫条件下脊尾白虾（Exopalamoncarin cauda）ferritin基因及热休克蛋白70基因表达特征

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