学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

红笛鲷非特异性细胞毒性细胞活性及其受体表达的研究

作　者: 周晴
导　师: 简纪常
学　校: 广东海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: 红笛鲷 NCCRP-1 NCC 表达荧光定量PCR
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 7次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

本论文以我国南方主要海水养殖鱼类之一——红笛鲷（Lutjanus sanguineus）为研究对象，制备了兔抗红笛鲷非特异性细胞毒性细胞（NCC）受体NCCRP-1融合蛋白的抗血清，初步建立了NCC的有效分离手段，探讨了NCC的活性以及抗血清对NCC活性的抑制作用，成功构建了真核表达载体PGBKT7-NCCRP，研究了NCCRP-1的基因表达。将表达的NCCRP-1融合蛋白进行纯化并利用纯化后的融合蛋白按常规方法免疫新西兰纯种大白兔，制备了兔抗红笛鲷NCCRP-1融合蛋白的抗血清，ELISA测定其效价为1:32000。利用该抗血清进行免疫组织化学分析，发现NCCRP-1只在头肾、脾脏和胸腺的特定细胞中表达。为深入研究NCCRP-1抗血清对红笛鲷NCC活性的抑制作用，首先分离红笛鲷头肾中的NCC，选用NCC特异性的作用对象之一——人类细胞系K562为靶细胞，通过流式细胞仪检测了NCC杀伤K562的活性；并在效应细胞和靶细胞中加入一定量的兔抗红笛鲷NCCRP-1融合蛋白抗血清，分析了抗血清对NCC活性的抑制作用。结果表明，用48%的Percoll细胞分离液，在400×g，30min的条件下分离出来的NCC效果最佳，流式细胞仪检测NCC占整个白细胞的比例约为(44.8±0.8)%。当效应细胞NCC和靶细胞K562以一定的比例混合后，流式细胞仪检测发现NCC具有很强的杀细胞活性，且这个活性并不随着两种细胞的比例变化而变化；当效应细胞和靶细胞比例为1:1并加入不同体积倍比稀释的抗血清时，所制备的兔抗红笛鲷NCCRP-1融合蛋白抗血清可抑制NCC的活性，其抑制率随着抗血清体积的变化而变化。利用PGBKT7质粒，成功构建了真核表达载体PGBKT7-NCCRP，为进一步研究NCCRP-1蛋白的功能奠定基础。应用Real-time PCR技术，研究脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激红笛鲷后NCCRP-1在不同组织里的表达水平差异，结果发现，LPS刺激红笛鲷24h后NCCRP-1在红笛鲷头肾、脾脏、胸腺、肝脏、心脏、脑、肌肉和肠组织中均有表达，其中头肾表达量最高，脾脏次之，然后依次是肝脏、脑、肌肉、胸腺和肠，心脏表达量最少。LPS、苯酚和CuSO4刺激红笛鲷后，随着刺激时间的增长，NCCRP-1表达量在各组织达到峰值的时间不同。以头肾为模式组织，RT-PCR的结果显示，红笛鲷NCCRP-1在LPS、苯酚和CuSO4的刺激下的表达模式相似，随着时间的增加NCCRP-1表达量逐渐增加，分别在24h、9h和12h处达到最高，达到对照组表达量的52倍、30倍和24倍左右，接着开始下调。本文初步探讨了NCC的活性及其受体NCCRP-1在先天性免疫中的基本功能，为红笛鲷疾病防治提供一定的理论依据，为进一步研究NCCRP-1蛋白的生物学特性奠定基础。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-15
1 文献综述  15-21
  1.1 鱼类免疫系统的研究进展  15-18
    1.1.1 免疫组织和器官  15-16
    1.1.2 免疫细胞  16-17
    1.1.3 体液免疫因子  17-18
  1.2 鱼类非特异性细胞毒性细胞（NCC）的研究进展  18-20
  1.3 本文研究的目的意义  20-21
2 兔抗红笛鲷 NCCRP-1 融合蛋白抗血清的制备及免疫组织化学分析  21-34
  2.1 引言  21
  2.2 实验材料  21-24
    2.2.1 实验对象  21
    2.2.2 实验菌株  21
    2.2.3 主要试剂及试剂盒  21
    2.2.4 主要溶液及试剂的配制方法  21-23
    2.2.5 主要实验仪器  23-24
  2.3 实验方法  24-28
    2.3.1 NCCRP-1 融合蛋白的制备  24-26
    2.3.2 蛋白质浓度测定  26
    2.3.3 抗血清的制备  26
    2.3.4 血清效价的测定  26-27
    2.3.5 冰冻切片的制作  27
    2.3.6 免疫组化染色  27-28
  2.4 实验结果  28-32
    2.4.1 重组菌在优化条件下表达目的蛋白的纯化及 Western blot 分析  28-29
    2.4.2 蛋白质浓度测定  29
    2.4.3 兔抗血清效价  29
    2.4.4 免疫组化分析  29-32
  2.5 讨论  32-34
3 红笛鲷 NCC 活性的研究  34-43
  3.1 引言  34
  3.2 实验材料  34-36
    3.2.1 实验对象  34
    3.2.2 实验靶细胞  34
    3.2.3 主要试剂及试剂盒  34-35
    3.2.4 主要溶液及试剂的配制方法  35-36
    3.2.5 主要实验仪器  36
  3.3 实验方法  36-37
    3.3.1 红笛鲷头肾 NCC 的分离  36
    3.3.2 靶细胞的培养  36
    3.3.3 流式细胞仪分析头肾 NCC 的数量  36-37
    3.3.4 NCC 杀伤活性分析  37
    3.3.5 兔抗红笛鲷 NCCRP-1 融合蛋白抗血清对 NCC 活性的抑制实验  37
  3.4 实验结果  37-40
    3.4.1 红笛鲷头肾 NCC 的分离  37-38
    3.4.2 流式细胞仪分析头肾 NCC 的数量  38
    3.4.3 NCC 杀伤活性分析  38-40
    3.4.4 兔抗红笛鲷 NCCRP-1 融合蛋白抗血清对 NCC 活性的抑制实验  40
  3.5 讨论  40-43
4 红笛鲷 NCCRP-1 基因真核表达载体的构建  43-54
  4.1 引言  43
  4.2 实验材料  43-46
    4.2.1 实验对象  43
    4.2.2 实验所用基因  43
    4.2.3 质粒载体和受体菌株  43-44
    4.2.4 主要试剂、工具酶及试剂盒  44-45
    4.2.5 主要溶液和试剂的配制方法  45
    4.2.6 主要仪器  45-46
  4.3 实验方法  46-51
    4.3.1 红笛鲷总 RNA 的提取  46
    4.3.2 引物的设计  46
    4.3.3 红笛鲷 NCCRP-1 基因的 ORF 扩增  46-47
    4.3.4 PCR 产物切胶回收  47
    4.3.5 PCR 产物与 T 载体的连接  47-48
    4.3.6 大肠杆菌 DH5α感受态的制备  48
    4.3.7 转化  48
    4.3.8 阳性克隆筛选及测序  48
    4.3.9 重组克隆质粒 pMD18T-NCCRP 及 pGBKT7 质粒的提取  48-49
    4.3.10 重组克隆质粒 pMD18T-NCCRP 及 pGBKT7 质粒的双酶切  49
    4.3.11 酶切产物的纯化  49-50
    4.3.12 连接  50
    4.3.13 转化  50
    4.3.14 重组质粒阳性克隆筛选及测序  50-51
  4.4 实验结果  51-53
    4.4.1 NCCRP-1 基因的 ORF 扩增  51
    4.4.2 pMD18T-NCCRP 质粒双酶切  51-52
    4.4.3 菌落 PCR 筛选阳性克隆与重组质粒双酶切鉴定  52-53
  4.5 讨论  53-54
5 NCCRP-1 基因在红笛鲷中表达差异的研究  54-68
  5.1 引言  54
  5.2 实验材料  54
  5.3 实验方法  54-55
    5.3.1 采样  54
    5.3.2 样品分析  54-55
    5.3.3 数据统计与分析  55
  5.4 实验结果  55-67
    5.4.1 LPS 刺激红笛鲷 24h 后 NCCRP-1 基因的组织表达差异  55-56
    5.4.2 LPS 刺激红笛鲷后各组织 NCCRP-1 基因的时间表达差异  56-60
    5.4.3 苯酚处理红笛鲷后各组织 NCCRP-1 基因的时间表达差异  60-63
    5.4.4 CuSO4处理红笛鲷后各组织 NCCRP-1 基因的时间表达差异  63-67
  5.5 讨论  67-68
6 结论  68-69
  6.1 兔抗红笛鲷 NCCRP-1 融合蛋白抗血清的制备及免疫组织化学分析  68
  6.2 红笛鲷 NCC 活性的研究  68
  6.3 红笛鲷 NCCRP-1 基因真核表达载体的构建  68
  6.4 NCCRP-1 基因在红笛鲷中表达差异的研究  68-69
参考文献  69-76
致谢  76-77
作者简历  77-78
导师简介  78

红笛鲷非特异性细胞毒性细胞活性及其受体表达的研究

内容摘要

全文目录

相似论文