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氯霉素单克隆抗体的制备及免疫检测方法的初步建立

作　者: 杨帆
导　师: 闫静辉; 刘敬泽
学　校: 河北师范大学
专　业: 生态学
关键词: 氯霉素全抗原单克隆抗体 ELISA
分类号: S859.84
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

氯霉素（Chloramphenicol，CAP）又名左旋氯霉素、左霉素、氯胺苯醇，是一种相对便宜的，高度有效的广谱抑菌性抗生素。但是，氯霉素含有毒性，氯霉素药物的滥用，会对人和动物体产生毒副作用，造成母畜的流产、早产，致使牲畜的生育能力降低、产仔数量减少等。氯霉素还会使人体产生多种疾病，如视神经炎、灰色综合症、肝损伤、血液疾病等，氯霉素甚至能直接导致人和动物体的死亡。目前，氯霉素的检测主要有微生物法、酶联免疫吸附法（ELISA）、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)和液相色谱-质谱联用法（LC-MS）等。微生物法特异性差、灵敏度低、所需时间长。液相色谱-质谱联用法和气相色谱-质谱联用法能在抗生素低残留水平上对氯霉素进行检测，并且特异性强，但是所用仪器昂贵、样品预处理时间长。ELISA方法灵敏度高、特异性强、所需时间短、能够同时检测大量的样品，也不需要昂贵的仪器，适合基层实验人员进行大量样品的检测。本实验即是使用ELISA方法对氯霉素残留物进行检测。本实验使用重氮化法针对氯霉素所含有的硝基，选用牛血清白蛋白和卵清白蛋白作为载体蛋白，对氯霉素小分子进行偶联。偶联完成后用SDS-PAGE电泳法、紫外分光光谱法、红外扫描图谱方法定性和定量的证明了氯霉素全抗原合成实验的偶联成功，偶联比率分别为：CAP-BSA17.1:1、CAP-OVA10:1。本实验用CAP-BSA作为免疫原免疫了三只Balb/c小鼠，采用间接ELISA方法对小鼠血清抗体效价进行检测，抗体效价分别为1：6400、1：6400、1：12800，并对小鼠血清进行敏感性测定，选取小鼠血清效价和敏感性最好的三号小鼠进行融合实验。细胞融合实验后，筛选出了三株效果好的杂交瘤细胞，分别为2A6、4E10、4E12。将这三株细胞分别注射到Balb/c小鼠腹腔中，7天后收集腹水，检测效价，2A6、4E10、4E12的杂交瘤细胞株的细胞培养上清液的效价分别为1：12800、1:6400、1:6400。2A6、4E10、4E12的腹水抗体效价分别为1:51200、1:25600、1:25600。选取2A6的抗体，采用竞争ELISA法对其灵敏度和特异性进行测定，证明了所制备的2A6抗体是针对CAP的，且具有较好的特异性，测定了CAP标准品的IC50值为3.125ppb。本实验还对氯霉素的类似物进行了交叉反应实验，测得氯霉素2A6抗体与氟苯尼考、甲砜霉素、四环素、磺胺二甲嘧啶的交叉反应率都低于0.01％，说明本实验制备的抗氯霉素单克隆抗体具有良好的特异性。本实验使用间接竞争ELISA法对CAP残留物进行检测，所得的灵敏度达到2.213ppb,该方法对标准品的检测限为0.17ppb。本研究制备了抗氯霉素的单克隆抗体，初步建立了检测氯霉素的酶联免疫方法，并对反应条件中的抗原抗体反应时间、一抗浓度、抗原包被条件、酶标二抗浓度和包被浓度五个条件进行了优化。本实验为进一步研究氯霉素残留物的检测产品提供了理论基础。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-12
引言  12-13
1 文献综述  13-20
  1.1 氯霉素  13-14
    1.1.1 氯霉素的结构特征和作用机理  13
    1.1.2 危害  13-14
  1.2 氯霉素的合成方法  14-16
    1.2.1 偶联方法的选择  15
    1.2.2 氯霉素半抗原与载体蛋白偶联条件的选择  15-16
  1.3 氯霉素全抗原的鉴定  16
    1.3.1 SDS-PAGE 电泳法  16
    1.3.2 红外光谱法  16
    1.3.3 紫外光谱法  16
  1.4 小鼠免疫与抗体制备  16-17
  1.5 氯霉素检测方法  17-19
    1.5.1 微生物法  17-18
    1.5.2 酶联免疫法  18
    1.5.3 物理法  18-19
  1.6 实验目的与意义  19-20
2 氯霉素全抗原的合成与鉴定  20-28
  2.1 材料与方法  20-23
    2.1.1 试剂  20
    2.1.2 仪器  20
    2.1.3 方法  20-23
      2.1.3.1 偶联载体的选择  20
      2.1.3.2 氯霉素全抗原的合成  20-21
      2.1.3.3 合成抗原蛋白浓度测定  21
      2.1.3.4 氯霉素合成抗原的鉴定  21-23
  2.2 结果与分析  23-27
    2.2.1 紫外光谱法结果  23-25
    2.2.2 SDS-PAGE 电泳法结果  25
    2.2.3 红外光谱法结果  25-27
  2.3 小结  27-28
3 氯霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立  28-36
  3.1 材料与方法  28-32
    3.1.1 试剂  28
    3.1.2 仪器  28
    3.1.3 方法  28-32
      3.1.3.1 动物免疫  28-29
      3.1.3.2 小鼠血清效价测定  29-30
      3.1.3.3 血清敏感性测定  30
      3.1.3.4 细胞融合  30-32
  3.2 结果与分析  32-34
    3.2.1 小鼠血清效价测定  32-33
    3.2.2 小鼠血清敏感性测定  33
    3.2.3 融合实验结果  33-34
  3.4 小结  34-36
4 氯霉素单克隆抗体的制备及特性鉴定  36-41
  4.1 材料和方法  36-38
    4.1.1 试剂  36
    4.1.2 仪器  36
    4.1.3 方法  36-38
      4.1.3.1 单克隆抗体的制备  36
      4.1.3.2 单克隆抗体的纯化  36-37
      4.1.3.3 单克隆抗体效价测定  37
      4.1.3.4 单克隆抗体特异性测定  37
      4.1.3.5 单克隆抗体敏感性测定  37-38
  4.2 结果与分析  38-39
    4.2.1 抗体效价测定  38
    4.2.2 抗体特异性测定  38-39
    4.2.3 抗体灵敏度测定  39
    4.2.4 抗体交叉反应测定  39
  4.3 小结  39-41
5 氯霉素酶联免疫检测技术的初步建立  41-48
  5.1 材料与方法  41-43
    5.1.1 试剂  41
    5.1.2 仪器  41
    5.1.3 方法  41-43
      5.1.3.1 抗原包被条件的确定  41-42
      5.1.3.2 抗原抗体反应时间的确定  42
      5.1.3.3 酶标二抗反应时间的确定  42
      5.1.3.4 抗体工作浓度的确定  42
      5.1.3.5 间接竞争 ELISA 法检测 CAP 残留标准曲线的建立  42-43
      5.1.3.6 灵敏度和最低检测限的测定  43
  5.2 结果  43-47
    5.2.1 抗原包被条件确定  43
    5.2.2 抗体反应时间确定  43-44
    5.2.3 包被抗原、单抗及酶标二抗工作浓度的确定  44-45
    5.2.4 氯霉素抗体抑制率测定  45-47
    5.2.5 CAP 残留的灵敏度和最低检测限的测定  47
  5.3 小结  47-48
结论  48-50
参考文献  50-54
附录  54-55
致谢  55-56
攻读学位期间取得的科研成果  56

氯霉素单克隆抗体的制备及免疫检测方法的初步建立

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