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口蹄疫病毒非结构蛋白竞争ELISA检测试剂盒的研制

作　者: 陆明哲
导　师: 王斌
学　校: 青岛大学
专　业: 病原生物学
关键词: 口蹄疫非结构蛋白 3ABC蛋白竞争ELISA 特异性敏感性
分类号: S854.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

目的为提高口蹄疫诊断试剂的敏感性和特异性，拓宽试剂的使用范围，用非结构蛋白研制重组抗原和高免血清，建立鉴别口蹄疫免疫动物与感染动物的竞争ELISA方法。材料与方法1、口蹄疫病毒非结构蛋白的质粒构建与表达结果鉴定：以口蹄疫病毒RNA为模板，扩增3ABC蛋白基因片段，一方面以扩增片段构建A-3ABC重组质粒，另一方面将扩增产物标记，构建B-3ABC重组质粒。对表达产物分别进行运用SDS-PAGE、ELISA试验，并对结果进行鉴定。2、竞争ELISA条件的建立：通过棋盘滴定试验确定抗原包被浓度、阴性与阳性血清、高免血清、酶标二抗的稀释度；研究确定的相应的温度、时间，从而建立竞争ELISA条件；并根据临床样品数据分析，确定判断标准。3、运用已知阴性血清、阳性血清、人工感染血清、临床血清和相关疫病阳性血清进行竞争ELISA测定，分别计算阴性样品检出率、阳性样品检出率，以及批内、批间重复试验的变异系数，进行试剂盒特异性、敏感性、制备工艺的可重复性研究；4、试剂保存条件研究：针对抗原包被板等不同试剂盒组份分别置于2～8℃、37℃保存，定期检测相关指标或检验活性，研究确定不同试剂的保存条件及有效期。结果表达蛋白显示特异的免疫学活性，并能区分感染动物和免疫动物。抗原包被最佳浓度为1：320，临床血清的稀释度为1：40，高免血清最大稀释度为1：5000，酶标二抗稀释度为1：4000；确定试验判断标准为抑制率(pI)＞50％为阳性，PI＜40％为阴性，40％＜PI＜50％为可疑。试剂盒最早能于动物感染后第7天测出抗体，特异性达98.15％，敏感性达90.67％。试剂盒与美国UBI试剂盒作比较，符合率达91.2％。试剂盒在2～8℃可保存一年。结论研究结果提示利用非结构蛋白(3ABC)作抗原建立的竞争ELISA方法能够区分感染抗体与免疫抗体，研制的检测试剂具有较高的特异性、敏感性，与国际商业化诊断试剂盒相比有较高的符合率，具有较好的推广应用价值。

全文目录

摘要  2-3
Abstract  3-5
前言  5-8
第一部分口蹄疫非结构蛋白的质粒构建与表达结果鉴定  8-13
  1 材料  8
  2 主要仪器  8-9
  3 方法  9-10
  4 结果  10-13
第二部分口蹄疫非结构蛋白竞争ELISA方法的建立及试剂盒制备工艺探索  13-19
  1 材料  13
  2 主要仪器语念  13
  3 方法  13-15
  4 结果  15-19
第三部分试剂盒敏感性研究  19-22
  1 材料  19
  2 方法  19
  3 结果  19-22
第四部分试剂盒特异性研究  22-25
  1 材料  22
  2 方法  22
  3 结果  22-25
第五部分试剂盒批内批间重复性研究  25-27
  1 材料  25
  2 方法  25
  3 结果  25-27
第六部分试剂盒保存条件及有效期研究  27-30
  1 材料及仪器设备  27
  2 方法  27-28
  3 结果  28-30
讨论  30-32
小结  32-33
参考文献  33-37
文献综述  37-49
致谢  49-50

口蹄疫病毒非结构蛋白竞争ELISA检测试剂盒的研制

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