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凝血因子Ⅶ检测试剂的研制

作 者: 王丽洁
导 师: 肖小璞;林方昭;吴纬
学 校: 北京协和医学院
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 凝血因子Ⅶ 缺凝血因子Ⅶ血浆 单克隆抗体 免疫亲和层析
分类号: R944
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要


目的:优化从Cohn氏法组分Ⅲ(组分Ⅲ)中纯化人凝血因子Ⅶ(FⅦ)的方法;制备和纯化特异性人凝血因子Ⅶ单克隆抗体(FⅦMcAb);利用FⅦMcAb制备FⅦ凝固活性(FⅦ:C)检测主要试剂——FⅦ缺乏血浆(FⅦDP)。方法:(1)将组分Ⅲ溶解,经柠檬酸钡吸附、洗脱、硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Heparin Sepharose CL-4B亲和层析纯化FⅦ。(2)复苏本实验室冻存的分泌人FⅦMcAb的杂交瘤细胞株并用ELISA法重新筛选;用杂交瘤细胞体内诱生法从小鼠的腹腔制备腹水,经过硫酸铵沉淀、DEAE-affi-gel-blue凝胶层析纯化单克隆抗体;鉴定抗体的亚类、抗体与凝血因子Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ(FⅡ、FⅨ、FⅩ)的交叉反应性、二价金属离子对抗原抗体结合的影响等特性。(3)将8株FⅦMcAb (1-8号)与CNBr-Activated Sepharose4B进行偶联,检测连接效率和连接后的抗体与血浆的反应;用4号FⅦMcAb制成的免疫亲和层析柱制备FⅦDP;采用凝血一期法检测自制FⅦDP中各凝血因子促凝活性并考察3批次自制FⅦDP的精密度,对比自制FⅦDP和同类进口FⅦDP产品的测定线性范围,分别使用自制FⅦDP和同类进口FⅦDP产品检测不同FⅦ水平样品的效果。结果:(1)组分Ⅲ经过溶解、柠檬酸钡吸附、盐析和两步层析纯化使FⅦ浓缩了(4954.22±164.43)倍,比活性为(147.19±4.89)U/mg,回收率为(21.09±1.93)%(n=5)。(2)成功复苏10株抗人FⅦ杂交瘤细胞,从其中选取8株重新编号为1-8号,制备腹水,并对抗体进行了纯化。8株抗体的亚类均为IgG1;抗体与FⅡ、FⅨ、FⅩ均没有交叉反应;其中有4株抗体可以抑制血浆FⅦ的凝固活性。(3)4号FⅦMcAb偶联的CNBr-Activated Sepharose4B可以吸附血浆中接近90%的FⅦ。1、2、6号FⅦMcAb也可部分吸附血浆中的FⅦ,但吸附率较低(不到50%)。采用4号FⅦMcAb免疫亲和层析胶制得3批FⅦDP,经初步考察该血浆线性范围广(1.625%-100%),标准曲线(相关系数分别为r=-0.998,r=-0.996,r=-0.996)与同类进口产品(r=0.-998)基本一致,精密度高(3批次自制FⅦDP批内精密度分别为Sr=3.30,Sr=3.36,Sr=3.30,批内变异系数分别为4.12%,4.11%,3.98%;批间精密度为Srr=4.20,批间变异系数为4.99%),经相关分析,自制FⅦDP对于不同FⅦ水平的样品的检测效果与同类进口产品一致(相关系数分别为r=0.97,r=0.96,r=0.97)。结论:本实验设计的联合应用离子交换层析和肝素亲和层析法能够从组分Ⅲ中得到纯度较高的FⅦ;成功复苏并筛选出8株本实验室冻存的能分泌FⅦMcAb的杂交瘤细胞株并制备出相应的FⅦMcAb;应用FⅦMcAb免疫亲和层析柱成功研制出FⅦDP;经初步评价该FⅦDP性能良好,可作为FⅦ检测试剂使用。

全文目录


中文摘要  6-8
Abstract  8-10
前言  10-12
第一部分 凝血因子Ⅶ的分离纯化  12-23
  1 材料  12-14
    1.1 原料  12
    1.2 仪器与器材  12-13
    1.3 试剂  13-14
  2 方法  14-19
    2.1 试剂配制  14-15
    2.2 实验方法  15-19
  3 结果  19-21
    3.1 预处理  19
    3.2 DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析  19
    3.3 Heparin Sepharose CL-4B亲和层析  19-20
    3.4 SDS-PAGE鉴定结果  20-21
    3.5 凝血因子Ⅶ纯化相关数据分析处理  21
  4 讨论  21-23
    4.1 原料  21-22
    4.2 层析介质  22-23
第二部分 凝血因子Ⅶ单克隆抗体的制备与鉴定  23-40
  1 材料  23-25
    1.1 动物与细胞  23
    1.2 仪器与器材  23-24
    1.3 试剂  24-25
  2 方法  25-30
    2.1 试剂配制  25-26
    2.2 间接ELISA方法检测抗体  26-27
    2.3 杂交瘤细胞的培养  27-28
    2.4 抗体的制备  28-29
    2.5 抗体的性质鉴定  29-30
  3 结果  30-37
    3.1 杂交瘤细胞的复苏  30
    3.2 培养上清中抗体滴度的检测  30
    3.3 杂交瘤细胞的冻存  30-31
    3.4 抗体的制备  31-32
    3.5 抗体的性质鉴定  32-37
  4 讨论  37-40
    4.1 培养基和血清  38
    4.2 温度和CO_2浓度  38
    4.3 培养板和培养瓶  38
    4.4 生物污染  38-39
    4.5 动物的选择  39
    4.6 免疫抑制剂  39
    4.7 抗体的纯化  39-40
第三部分 凝血因子Ⅶ缺乏血浆的研制  40-52
  1 材料  40-41
    1.1 原料血浆  40
    1.2 仪器与器材  40-41
    1.3 试剂  41
  2 方法  41-45
    2.1 试剂配制  41-42
    2.2 凝血因子Ⅶ单克隆抗体免疫亲和层析柱的制备  42-43
    2.3 凝血因子Ⅶ缺乏血浆的制备  43
    2.4 凝血因子Ⅶ缺乏血浆中相关指标的检测  43-44
    2.5 精密度  44-45
  3 结果  45-50
    3.1 凝血因子Ⅶ单克隆抗体的偶联及制备凝血因子Ⅶ缺乏血浆  45
    3.2 自制凝血因子Ⅶ缺乏血浆与原料血浆中所含凝血因子活性比较  45
    3.3 3 批次自制凝血因子Ⅶ缺乏血浆的精密度  45-48
    3.5 自制凝血因子Ⅶ缺乏血浆与同类进口产品的线性范围比较  48
    3.6 自制3批次凝血因子Ⅶ缺乏血浆与同类进口产品对不同水平的凝血因子Ⅶ样品的检测结果  48-50
  4 讨论  50-52
    4.1 凝血因子Ⅶ单克隆抗体的选择  50
    4.2 凝血因子Ⅶ单克隆抗体与亲和胶的偶联  50-51
    4.3 凝血因子Ⅶ缺乏血浆的制备  51
    4.4 成本核算  51-52
参考文献  52-57
文献综述  57-64
  参考文献  61-64
致谢  64

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药剂学 > 剂型
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