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PRRSV JL/07/SW分离株GP5基因克隆与真核表达及间接ELISA方法的建立

作　者: 白晶
导　师: 剡根强；丁壮
学　校: 石河子大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5基因 克隆 表达 间接ELISA
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 15次
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内容摘要


根据猪繁殖与呼吸综合症病毒美洲型毒株VR-2332株的基因序列,设计了一对GP5基因特异性引物P1/P2,以PRRSVJL/07/SW毒株细胞培养物为模板.利用RT-PCR方法,成功扩增出GP5基因,然后以pMD18-T为载体对GP5基因进行克隆。序列测定结果表明,GP5基因全长603bp,编码201个氨基酸；序列分析表明,GP5基因与VR-2332株和LV株核苷酸同源性分别为91.6%及48.7%,编码氨基酸同源性分别为87.6%及60.0%。将GP5基因亚克隆到pCI-neo表达载体中,构建表达质粒pCI-GP5.将重组质粒转染Marc-145细胞中,用间接免疫荧光试验、SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达。结果表达出约25 KDa融合蛋白,经Western-blot免疫印迹分析,重组蛋白与抗PRRSV的阳性血清发生特异性反应,表明其具有抗原活性。用重组表达的融合GP5蛋白作为包被抗原,经Western-blot分析表明,该重组蛋白可以与PRRSV阳性血清反应并具有良好的反应性,以此纯化的重组蛋白建立了诊断PRRS的间接ELISA方法。实验确定了最佳抗原包被浓度为2.30μg/mL, PRRSV阳性血清稀释度为1：100。用间接ELISA方法检测PRRS与猪的其它常见疾病均无交叉反应,特异性强。本论文研究PRRSV GP5基因的克隆与分析,应用分子生物学技术将PRRSV GP5基因与真核表达载体pCI-neo连接并建立间接ELISA方法,对PRRSV JL/07/SW株的病原分子生物学特点进行研究,并建立了初步的诊断方法。该研究对于PRRS的病原学研究、流行病学调查及诊断防治均具有重要意义。为下一步研究各结构基因的功能及其免疫原性奠定了基础。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-9
英文缩写词表  9-10
前言  10-11
第一部分 文献综述  11-20
  第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展  11-16
    1. PRRSV的基因组结构及相关蛋白  11-14
      1.1 PRRSV基因组结构  11-12
      1.2 PRRSV基因组编码的蛋白质  12-14
    2 PRRSV免疫学特性  14-16
      2.1 体液免疫  14-15
      2.2 细胞免疫  15-16
  第二章 真核表达系统及在病毒研究中的应用  16-20
    1 各种真核表达系统的特点  16-18
      1.1 酵母表达系统  16-17
      1.2 昆虫杆状病毒表达系统  17
      1.3 哺乳动物细胞表达系统  17-18
    2 真核细胞表达系统的应用与前景  18-20
      2.1 酵母表达系统的应用与前景  18-19
      2.2 杆状病毒表达系统的应用前景  19
      2.3 哺乳动物细胞表达系统的发展趋势  19-20
第二部分 研究内容  20-53
  第一章 PRRSV JL/07/SW毒株GP5基因的克隆与分析  20-33
    1 材料  20-22
      1.1 病毒、菌种、细胞和克隆载体  20
      1.2 实验试剂与耗材  20
      1.3 主要仪器  20-21
      1.4 溶液配制  21-22
    2 方法  22-26
      2.1 PRRSV的培养增殖  22
      2.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组RNA的提取  22-23
      2.3 PRRSV GP5基因的扩增  23-26
    3 结果  26-31
      3.1 电镜结果  26
      3.2 RT-PCR扩增结果  26-27
      3.3 GP5基因的测序结果  27-28
      3.4 PRRSV JL/07/SW分离株GP5基因与核苷酸及氨基酸序列同源性比较  28-29
      3.5 PRRSV JL/07/SW分离株GP5基因遗传进化分析  29-30
      3.6 GP5蛋白抗原表位预测分析  30-31
    4 讨论  31-32
    5. 小结  32-33
  第二章 PRRSV JL/07/SW毒株GP5基因的真核表达  33-44
    1. 材料  33-35
      1.2 质粒与菌体  33
      1.3 酶与试剂  33-34
      1.4 主要仪器  34
      1.5 溶液及培养基  34-35
    2 方法  35-39
      2.1 PRRSV ORF5片段基因重组真核表达载体的构建及鉴定  35-36
      2.2 序列测定  36-38
      2.3 蛋白印迹(Western-blot)  38-39
    3 结果  39-42
      3.1 GP5基因重组真核表达载体的鉴定  39-40
      3.2 重组质粒pCI-GP5转染Marc-145细胞  40-41
      3.4 SDS-PAGE结果  41
      3.5 Western-blot结果  41-42
    4. 讨论  42-43
    5 小结  43-44
  第三章 PRRSV JL/07/SW毒株GP5重组蛋白间接ELISA方法的建立  44-53
    1 材料  44-45
      1.1 血清、蛋白  44
      1.2 试剂  44
      1.3 实验仪器  44-45
      1.4 实验用溶液配制  45
    2 方法  45-47
      2.1 PRRSV JL/07/SW株GP5重组蛋白的间接ELISA方法建立  45-47
    3 结果  47-51
      3.1 ELISA方阵试验及抗原最佳包被条件的测定  47-49
      3.2 间接ELISA特异性检测结果  49
      3.3 重复性实验  49-50
      3.4 猪繁殖与呼吸综合征病毒间接ELISA方法的应用  50-51
    4 讨论  51
    5. 小结  51-53
结论  53-54
参考文献  54-60
致谢  60-61
作者简介  61-62
导师评阅表  62

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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