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半滑舌鳎基因CathepsinB、D和L的鉴定与表达分析

作　者: 陈玲
导　师: 孙黎
学　校: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
专　业: 海洋生物学
关键词: 组织蛋白酶半滑舌鳎表达半胱氨酸蛋白酶
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

组织蛋白酶是溶酶体蛋白酶中的一大家族，在蛋白降解、抗原提呈、细胞凋亡以及炎症反应中发挥重要作用。组织蛋白酶家族可以分为三类，分别为半胱氨酸蛋白酶（包括组织蛋白酶B和L）、丝氨酸蛋白酶及天冬氨酸蛋白酶（包括组织蛋白酶D）。组织蛋白酶B、D和L已在许多其他物种如哺乳动物、昆虫和贝类等发现，并进行了相关功能研究，但是，在鱼类中它们的研究却很少。本研究从半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)中克隆了组织蛋白酶B、D和L的同源物，分别命名为CsCatB、CsCatD和CsCatL，并分析了它们在不同条件下的表达变化情况以及酶活特性。CsCatB编码322个氨基酸，与其他硬骨鱼及哺乳动物中的组织蛋白酶B有70–81.3%的全序列同源性。CsCatB具有典型组织蛋白酶的结构特征，包括有前肽区和半胱氨酸蛋白酶结构域，后者包含了四个高度保守的催化位点Q101,C107,H277,和N297。实时定量RT-PCR结果显示，CsCatB在多个组织中均有表达，在细菌和亚单位疫苗刺激后表达上调。重组表达的CsCatB表现出明显的蛋白酶活性，其最适温度为35°C，最适PH为5.5。当CsCatB的H277突变为谷氨酸后，其蛋白酶活性显著下降。CsCatD编码396个氨基酸，与其他鱼类及哺乳动物中的组织蛋白酶D有67.6-88.4%的全序列同源性。CsCatD具有天冬氨酸内肽酶结构域，包含由两个天冬氨酸形成的催化位点。CsCatL编码336个氨基酸，与其他鱼类以及哺乳动物组织蛋白酶L有64.7-90.2%的同源性。CsCatLN端具有前肽抑制结构域，其下游是半胱氨酸蛋白酶结构域，含4个高度保守的催化位点，分别为Gln-133,Cys-139,His-279,和Asn-303。重组表达的CsCatL表现明显的蛋白酶活性。实时定量RT-PCR结果显示，CsCatD和CsCatL在多个组织中组成型表达，其表达量在心脏中最低，在肝脏中最高。在受到细菌、病毒以及亚单位疫苗刺激后，CsCatD和CsCatL在头肾及脾脏中的表达显著上调，并且这种诱导型表达是时间依赖性的。上述结果显示，CsCatB和CsCatD具有蛋白酶活性，并且可能在机体对细菌及疫苗的免疫应答中发挥作用，CsCatD和CsCatL除可能具有上述免疫功能外，还可能参与机体对病毒的免疫应答。

全文目录

致谢  4-5
摘要  5-6
Abstract  6-10
第一章前言  10-16
  1.1 半滑舌鳎简介  10-11
  1.2 鱼类免疫系统  11-12
  1.3 组织蛋白酶(Cathepsins)  12-15
    1.3.1 概述  12-13
    1.3.2 组织蛋白酶B(CathepsinB)  13-14
    1.3.3 组织蛋白酶D(CathepsinD)  14-15
    1.3.4 组织蛋白酶L(CathepsinL)  15
  1.4 本研究的目的与意义  15-16
第二章 CsCatB、D和L全长cDNA序列的获得及其生物信息学分析  16-27
  2.1 材料与方法  16-21
    2.1.1 实验材料  16
    2.1.2 CsCatB、D和L基因序列的获得  16-17
    2.1.3 CsCatD全长cDNA的获得  17-20
    2.1.4 CsCatD序列拼接  20
    2.1.5 CsCatB、D和L序列的生物信息学分析  20-21
  2.2 结果与讨论  21-27
    2.2.1 CsCatB、D和L全长cDNA的获得  21-24
    2.2.2 CsCatB、D和L的序列分析  24-27
第三章 CsCatB和L的表达纯化和活性分析  27-40
  3.1 材料与方法  27-35
    3.1.1 实验材料  27-28
    3.1.2 CsCatB和L开放阅读框以及CsCatBM的获得  28-30
    3.1.3 CsCatB和L及CsCatBM重组表达质粒的构建  30-32
    3.1.4 重组蛋白rCsCatB、L及rCsCatBM的表达纯化  32-34
    3.1.5 重组蛋白rCsCatB、L的酶活性分析  34-35
  3.2 结果  35-40
    3.2.1 CsCatB、L及CsCatBM的克隆  35
    3.2.2 rCsCatB、L及rCsCatBM的表达纯化  35-36
    3.2.3 rCsCatB及其突变型rCsCatBM的酶活性  36-37
    3.2.4 rCsCatB的最适温度  37-38
    3.2.5 rCsCatB的最适pH  38-39
    3.2.6 rCsCatL的酶活测定  39-40
第四章 CsCatB、D和L在半滑舌鳎组织中的表达分析  40-51
  4.1 材料与方法  40-44
    4.1.1 实验材料  40
    4.1.2 CsCatB、D和L在半滑舌鳎正常组织中表达情况研究  40-42
    4.1.3 CsCatB、D和L在半滑舌鳎受到细菌刺激后的表达研究  42-43
    4.1.4 CsCatB、D和L在半滑舌鳎接种疫苗后的表达研究  43
    4.1.5 CsCatD和L在半滑舌鳎受到病毒刺激后的表达研究  43-44
  4.2 结果与讨论  44-51
    4.2.1 CsCatB、D和LmRNA在半滑舌鳎中的组织特异性分布  44-46
    4.2.2 CsCatB、D和L在半滑舌鳎受到细菌刺激后的表达  46
    4.2.3 CsCatB、D和L在半滑舌鳎接种疫苗后的表达  46-50
    4.2.4 CsCatD和L在半滑舌鳎受到病毒刺激后的表达  50-51
结论  51-52
参考文献  52-56
附录— 缓冲液的配置  56-61
作者简历  61

半滑舌鳎基因CathepsinB、D和L的鉴定与表达分析

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