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环氧化酶-2及血管内皮生长因子在慢性粒细胞性白血病中的表达特点和意义研究

作　者: 龚凡杰
导　师: 张广森
学　校: 中南大学
专　业: 血液内科
关键词: 慢性粒细胞白血病骨髓单个核细胞 COX-2 VEGF 表达临床意义
分类号: R733.72
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

研究背景:血管增生是肿瘤发生发展中的重要特征。多种正性或负性调控因子参与肿瘤血管生成的调节,其中环氧化酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）和血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor,VEGF）是其中关键的正调节因子。两者不仅能促进血管内皮细胞分裂、增加肿瘤血管通透性,同时有促肿瘤细胞增殖,抗凋亡及加强肿瘤耐药等作用。环氧化酶（cyclooxygenase,COX）是人体前列腺素（PGs）合成过程中重要的限速酶,有COX-1和COX-2两种异构体。COX-1在大多数细胞中呈稳定表达,维持机体正常的生理功能;而COX-2则在各种病理过程中特别是肿瘤发生发展过程中呈诱导性表达。有研究表明,多数实体瘤病理组织中,COX-2存在过度表达,其表达水平与肿瘤的发生、进展和预后关系密切。抑制COX-2表达能有效抑制肿瘤血管生成、诱导肿瘤细胞凋亡并增强肿瘤细胞对化疗药物的反应。血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor,VEGF）是生长因子家族中的一员。正常生理条件下,VEGF在机体组织中呈低水平表达,以旁分泌形式调节血管内皮细胞生长。恶性肿瘤细胞能大量合成并分泌VEGF,通过旁分泌方式促进肿瘤血管增生,通过自分泌方式刺激肿瘤细胞自身增殖、抑制细胞凋亡,在肿瘤的发生发展过程中发挥作用。VEGF在肿瘤中的表达受多种因素的调节,其中,COX-2能催化花生四烯酸产生代谢物PGE₂正向调节VEGF的合成与分泌。在体外实验中,COX-2与VEGF的表达有明显的相关性。抑制COX-2的表达、降低PGE₂水平或采用VEGF的特异性抑制剂均能有效降低VEGF的表达水平,减少内皮分裂、抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡并提高肿瘤细胞对药物的敏感性。慢性粒细胞性白血病（chronic myeloid leukemia,CML）是一种造血干细胞恶性克隆性疾病。随着人们对CML发病机制的了解以及基因靶向药物——格列卫在CML治疗中的应用,CML的临床疗效已有了明显的改善,但远期效果仍不满意;对于进展和急变期慢粒患者,目前仍缺乏有力的治疗方案。因此,更加深入的揭示CML的发病机制,寻找有治疗意义的分子靶点,制定更加适合有效的治疗方案是当前迫切需要解决的问题。已有研究发现CML患者骨髓微血管密度异常增高,其白血病细胞中存在COX-2或VEGF的异常表达,但对于COX-2或VEGF在CML临床病程中表达特点的研究仍然缺乏。此外,对于两者的异常表达在CML临床中的意义、以及在CML患者骨髓单个核细胞中共表达的相关性和作用机制,国内外鲜有研究报道。本研究采用流式细胞仪技术、蛋白印迹（Western-Blot）、实时荧光定量PCR（Real time-PCR）及COX-2酶活性测定等方法从不同的角度观察了CML患者骨髓单个核细胞中COX-2的表达特点,分析COX-2的表达水平与CML患者多个临床参数之间的关系及其临床意义;定量测定血管内皮生长因子（VEGF）蛋白及mRNA在CML患者骨髓单个核细胞中的表达,探讨其临床价值;研究VEGF与COX-2在CML患者骨髓单个核细胞中表达的相关性,并进一步探讨COX-2与VEGF在CML肿瘤发生发展过程中可能的相互作用机制。第一部分COX-2基因/蛋白/活性在CML患者骨髓单个核细胞中的表达分布特点及临床意义目的:从基因和蛋白水平测定COX-2在CML患者骨髓单个核细胞中表达的特点;分析COX-2表达水平与CML临床参数间的关系及其临床意义。方法:收集60例不同病程分期CML患者及15例骨髓无恶性病变的对照骨髓标本,获取骨髓中的单个核细胞,采用流式细胞术、Western-Blot、实时荧光定量PCR及COX-2酶活性测定等技术对骨髓单个核细胞内COX-2的表达进行检测,比较CML患者与对照之间及不同病期CML患者之间COX-2表达的差异;比较骨髓单个核细胞COX-2表达水平与对应的临床参数间的关系。结果:（1）与对照比较,CML患者骨髓单个核细胞中COX-2阳性细胞百分率、阳性细胞荧光强度、COX-2蛋白含量、COX-2mRNA转录拷贝数及酶生物活性均呈显著性升高（P＜0.05）;（2）不同病期CML患者骨髓单个核细胞中COX-2表达水平无显著性差异（P＞0.05）;（3）初治CML患者骨髓单个核细胞COX-2蛋白表达水平与病人年龄呈负相关（P=0.008）,与患者脾脏大小（P=0.028）、外周血白细胞数呈正相关（P=0.017）;（4）骨髓单个核细胞中COX-2高表达患者进入CML加速和急变期的时间较COX-2低表达者明显缩短（P＜0.05）。结论:CML患者骨髓单个核细胞存在COX-2异常表达,COX-2的表达水平与CML患者的肿瘤负荷相关,COX-2高表达的CML患者的慢性期缩短,更易进入加速期或急变期。第二部分VEGF蛋白及mRNA在CML患者骨髓单个核细胞中的表达状态及意义目的:观察VEGF在CML患者骨髓单个核细胞中表达的状态并分析其临床意义。方法:收集60例不同病期CML患者及15例骨髓无恶性病变的对照骨髓标本,获取骨髓中的单个核细胞,采用流式细胞术及实时荧光定量PCR测定技术对骨髓单个核细胞内VEGF蛋白及mRNA的表达进行检测,比较CML患者与对照之间及不同病期CML患者之间VEGF表达的差异;比较患者骨髓单个核细胞VEGF表达水平与其对应的临床参数间的关系。结果:（1）与对照骨髓标本比较,CML患者骨髓单个核细胞中VEGF阳性细胞百分率、阳性细胞荧光强度、mRNA转录拷贝数均明显升高（P＜0.05）;（2）不同病期CML患者骨髓单个核细胞中COX-2表达水平无显著性差异（P＞0.05）;（3）初治CML患者骨髓单个核细胞VEGF蛋白表达水平与病人年龄呈负相关、与患者脾脏大小、外周血白细胞数及骨髓粒红比呈正相关（P＜0.05）;（4）VEGF高表达患者进入CML加速或急变期的时间明显短于VEGF低表达者。结论:VEGF在不同时期CML患者骨髓中均存在异常高表达,VEGF的表达水平与CML患者的肿瘤负荷相关,高表达的VEGF对CML的预后判定有一定的临床意义。第三部分COX-2与VEGF在CML患者骨髓单个核细胞中表达的相关性及临床意义目的:观察COX-2及VEGF在不同病期CML患者骨髓单个核细胞中共表达的状态;比较COX-2与VEGF在CML中表达的相关性,揭示两者在CML疾病发生发展中的相互作用及与临床的相关性。方法:对前两部分收集并测定的患者COX-2及VEGF的数据进行进一步分析,比较不同病期CML患者骨髓单个核细胞中VEGF与COX-2蛋白及基因的共表达状态,确定两者的相关性并探讨两者在CML发病过程中的相互作用及意义。结果:不同病期CML患者均存在VEGF与COX-2高表达,各组间表达水平无明显差异;COX-2与VEGF在蛋白及基因表达水平上呈显著正相关（P＜0.05）。结论:COX-2与VEGF在不同病期的CML患者中呈共同高表达;COX-2与VEGF在CML的发病过程中可能存在着相互作用。

全文目录

中文摘要  4-9
英文摘要  9-16
前言  16-18
第一部分 COX-2基因/蛋白/活性在CML患者骨髓单个核细胞中的表达分布特点及临床意义  18-43
  1.1 病例、材料和方法  18-26
  1.2 结果  26-39
  1.3 讨论  39-43
第二部分 VEGF蛋白及mRNA在CML患者骨髓单个核细胞中的表达状态及意义  43-56
  2.1 病例、材料和方法  43-47
  2.2 结果  47-53
  2.3 讨论  53-56
第三部分 COX-2与VEGF在CML骨髓单个核细胞中表达的相关性及临床意义  56-68
  3.1 病例、材料和方法  56-59
  3.2 结果  59-65
  3.3 讨论  65-68
小结  68-69
参考文献  69-77
综述  77-93
致谢  93-94
攻读学位期间主要的研究成果  94

环氧化酶-2及血管内皮生长因子在慢性粒细胞性白血病中的表达特点和意义研究

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