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NMDA受体在OVA诱导大鼠哮喘发病机制中的介导作用及氯胺酮干预治疗机理研究

作　者: 朱敏敏
导　师: 傅诚章
学　校: 南京医科大学
专　业: 麻醉学
关键词: 氯胺酮哮喘气道反应性气道炎症氨基酸 N-甲基-D-天门冬氨酸受体一氧化氮合酶一氧化氮环-磷酸鸟苷卵蛋白肺泡巨噬细胞胞内游离钙羟自由基
分类号: R562.25
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

中枢谷氨酸受体在神经元的可塑性等生理作用和在急、慢性神经病变的病理生理方面的研究已取得相当多的进展。近些年外周组织或细胞中这些受体的存在及其重要性正逐渐引起国内外学者的关注。气道、肺组织存在NMDA受体的各种亚型，刺激气道的NMDA受体能引起离体气管条的收缩；而且呼吸道这些受体的过度激活，可能与这些区域的损伤和炎症的病理机制相关联，这种肺损伤与神经毒性类似，也是NMDA受体介导的、NO依赖性的。过度刺激NMDA受体所引起的肺的兴奋性毒性可能是导致急性支气管哮喘疾病中炎症和气道高反应的一个重要的病理机制。麻醉药氯胺酮属于苯环己哌啶拟似药，为NMDA受体的非竞争性抑制剂，有证据表明氯胺酮的麻醉、镇痛作用与阻滞NMDA受体的苯环己哌啶结合位点，从而非竞争性地抑制NMDA受体相关，这一药理特性对谷氨酸所介导的兴奋性毒性损伤可能提供保护作用。氯胺酮还因具有支气管舒张效应，被当作哮喘患者麻醉的首选药物，并被推荐用于严重支气管痉挛、哮喘急性发作和哮喘持续状态的治疗。近年来氯胺酮通过抗炎作用对肺损伤的保护效应已成为麻醉领域研究的热点。本研究探讨肺内谷氨酸和谷氨酸受体的病理生理意义与哮喘的炎症反应、氧化应激所造成的细胞损伤的关系及其氯胺酮在哮喘治疗中的抗炎、抗氧化作用与NMDA受体的关系。这将为临床肺部疾病的防治提供新的思路并将为阐明氯胺酮的作用机制提供有价值的实验资料和理论依据。第一部分氯胺酮对哮喘模型大鼠气道高反应及气道炎症的影响目的观察氯胺酮雾化吸入及全身给药对哮喘模型Brown-Norway大鼠气道高反应及气道炎症的影响。方法将52只Brown-Norway大鼠随机分成磷酸盐缓冲液（PBS）对照组（n=8）、卵蛋白（OVA）对照组（n=8）、不同浓度（12.5 mg/ml、25 mg/ml和50 mg／ml）氯胺酮雾化吸入处理组（n=8／group）、不同剂量（50μg／kg和100μg／kg）氯胺酮腹腔用药处理组（n=6/group）。采用OVA辅以百日咳杆菌菌苗和氢氧化铝为佐剂注射致敏大鼠。雾化吸入10 mg／ml OVA激发。PBS对照组采用PBS替代OVA进行雾化吸入。OVA对照组在激发前给予PBS雾化吸入，氯胺酮雾化吸入处理组大鼠在激发前分别给予12.5 mg/ml、25 mg／ml或50 mg／ml浓度的氯胺酮雾化吸入，氯胺酮腹腔用药处理组在激发前分别给予50μg／kg或100μg／kg剂量的氯胺酮腹腔注射。最后一次激发后18 hr，测定气道反应性，肺泡灌洗液细胞计数并取左侧肺作病理组织学检测。另取18只大鼠不致敏，单独给以12.5 mg/ml、25 mg／ml或50 mg／ml浓度氯胺酮雾化吸入（n=6／group）。作血浆药物浓度及病理组织学检测。结果（1）给予ACH剂量达到25μg／kg和50μg／kg，OVA组气道压力（P）增高、潮气量（Vt）下降、肺动态顺应性（Cldyn）下降幅度显著高于PBS组，呼气阻力（Re）增长百分率的剂量反应曲线向左上移位，而且PC100（Re增长达100％幅度时所需乙酰胆碱的激发剂量），PC200及PC400值显著低于PBS对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。与OVA组相比，氯胺酮处理组P值增高、Vt值及Cldyn值下降的幅度明显降低，Re剂量反应曲线向右下移位，而且PC100，PC200及PC400值均明显高于OVA对照组（P＜0.05）。（2）OVA对照组支气管肺泡灌洗液（BALF）中白细胞总数及嗜酸细胞、淋巴细胞比例显著增多。与OVA对照组相比，氯胺酮处理组白细胞总数、嗜酸细胞、淋巴细胞比例明显减低（P＜0.05）。（3）OVA对照组可见明显的气道炎症性病理改变。氯胺酮治疗组炎症细胞浸润及上皮细胞损伤程度明显减轻，肺间质水肿改善。（4）12.5、25和50 mg／ml浓度氯胺酮雾化吸入，其平均血浆浓度最大值分别为890.27、1313.48和2805.97μg／L。结论氯胺酮雾化吸入及全身用药均可抑制致敏原所激发的哮喘模型大鼠的气道炎症及气道高反应，对组织损伤有保护作用。第二部分氯胺酮对哮喘模型大鼠肺组织的NMDA-受体／NO的影响目的研究氯胺酮对哮喘模型大鼠肺组织内源性氨基酸产量、N-甲基-D-天门冬氨酸受体（NMDA-R1）表达、一氧化氮合酶（NOS）表达及环-磷酸鸟苷（cGMP）产量的影响。方法（1）模型及分组同第一部分。（2）高效液相色谱（HPLC）法检测肺组织主要氨基酸含量。（3）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）测定肺组织NMDA-R1，神经元型一氧化氮合酶（nNOS）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的信使核糖核酸（mRNA）水平。（4） Western蛋白印迹（Western-Blot）检测肺组织NMDA-R1，iNOS的蛋白表达量。（5）非放射酶免法检测肺组织cGMP含量。结果（1） OVA组肺组织中谷氨酸（Glu），甘氨酸（Gly）含量较PBS组明显增高。氯胺酮处理组与OVA组相比较，差异无统计学意义。（2） OVA组肺组织NMDA-R1及iNOS的mRNA和蛋白表达显著增强，而12.5 mg／ml和25 mg／ml氯胺酮雾化吸入治疗组以及50μg／kg氯胺酮腹腔注射治疗组表达较OVA组明显减弱。（3） OVA组肺组织cGMP含量显著增高，12.5 mg／ml和25 mg／ml氯胺酮雾化吸入治疗组以及50μg／kg和100μg／kg氯胺酮腹腔注射治疗组cGMP含量较OVA组明显降低。结论12.5 mg/ml和25 mg／ml氯胺酮雾化吸入以及50μg／kg氯胺酮腹腔注射均可抑制哮喘模型大鼠肺组织NMDA-R1、iNOS的mRNA和蛋白的过度表达，减少NO的产生，从而减轻哮喘大鼠的气道炎症性损伤。第三部分氯胺酮对卵蛋白激发的致敏大鼠离体肺泡巨噬细胞胞内钙和自由基的影响目的研究氯胺酮对OVA刺激的致敏大鼠肺泡巨噬细胞（AM）胞内游离钙离子浓度([Ca²⁺]_i)及自由基的作用，从而探讨氯胺酮在哮喘治疗中的作用及其机制。方法体外培养的AM经氯胺酮（10μM，100μM和1000μM）处理、OVA刺激后，测定细胞[Ca²⁺]_i并检测细胞培养上清液中一氧化氮（NO）和羟自由基（·OH）水平。结果OVA激发可引起致敏肺泡巨噬细胞[Ca²⁺]_i增高及NO和·OH的生成增多，氯胺酮对此具有浓度依赖性抑制作用。结论氯胺酮可抑制OVA所致的氧化应激，其分子机制可能与[Ca²⁺]_i相关。

全文目录

主要英文缩略语词表  3-6
中文摘要  6-13
英文摘要  13-23
前言  23-28
第一部分氯胺酮雾化吸入及全身给药对哮喘模型大鼠气道高反应及气道炎症的影响  28-69
  材料与方法  31-43
  结果  43-56
  讨论  56-64
  参考文献  64-69
第二部分氯胺酮对哮喘模型大鼠肺组织的NMDA受体/NO的影响  69-116
  实验一肺组织中氨基酸含量的检测  71-77
    材料与方法  71-73
    结果  73-77
  实验二大鼠肺组织中NMDA-R1和NOS基因表达的检测  77-86
    材料与方法  77-82
    结果  82-86
  实验三大鼠肺组织NNDA-R1和iNOS蛋白表达的检测  86-97
    材料与方法  86-95
    结果  95-97
  实验四大鼠肺组织cGMP含量的检测  97-102
    材料与方法  97-100
    结果  100-102
  讨论  102-116
第三部分氯胺酮对卵蛋白激发的致敏大鼠离体肺泡巨噬细胞胞内钙和自由基的影响  116-129
  材料和方法  117-121
  结果  121-124
  讨论  124-129
小结  129-130
参考文献  130-134
附录  134-136
致谢  136-138
综述  138-161
已发表论文  161-186

NMDA受体在OVA诱导大鼠哮喘发病机制中的介导作用及氯胺酮干预治疗机理研究

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