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吗啡诱导的心肌保护作用信号机制研究

作　者: 张磊
导　师: 徐哲龙；田炜
学　校: 华北煤炭医学院
专　业: 内科学
关键词: 吗啡 一氧化氮(NO) 环磷酸鸟苷(cGMP) 蛋白激酶G(PKG) 糖原合成激酶-3β(GSK-3β) 线粒体膜通透性转移孔(mPTP)
分类号: R542.22
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction, AMI）是一种急性心肌缺血性心脏病,过去主要在欧美国家常见,近年来由于我国人民生活水平的提高,心肌梗死发病率也日益增多。尽管心肌梗死引起的缺血/再灌注损伤在临床上受到了广泛的关注,但目前还没有减轻缺血/再灌注损伤的有效疗法。实验表明,阿片受体参与心脏预处理和后处理引起的心脏保护作用,但其具体机制尚不完全清楚。目的:本研究的目的是探讨吗啡作为公认的心肌保护物质是否通过合成一氧化氮（NO）来诱发细胞内锌离子(Zn2+)释放以抑制糖原合成激酶-3β（Glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β）的活性,从而阻止线粒体膜通透性转移孔（Mitochondrial Permeability Transition Pore,mPTP）开放,最终产生心肌保护作用。对象与方法:1以大鼠分离心肌细胞为研究对象。1.1用标记Zn2+的特异性荧光染料Newport Green DCF来测定细胞内Zn2+的释放;1.2用标记NO的特异性染料DAF-FM来检测细胞内NO的生成;1.3用标记线粒体膜电位的特异性染料Tetramethylrhodamine ethyl ester（TMRE）来测定细胞线粒体膜电位（△Ψm）的变化,以判断mPTP的开放程度;1.4用标记线粒体Ca2+的荧光染料Rhod-2来测定细胞线粒体内Ca2+的变化。上述荧光图像均通过共聚焦显微镜获得。1.5用Western blot法测定细胞内GSK-3β（Ser9）的磷酸化程度。2以大鼠心脏组织来源的H9c2心肌细胞株为研究对象,采用转染持续激活型GSK-3β突变基因的方法,探讨GSK-3β在Zn2+引起心肌保护中的作用。结果:1 Zn2+测定实验中,与空白对照组（109.8±9.4%）相比,吗啡使Zn2+特异性荧光标记染料Newport Green DCF的荧光强度明显增强（155.9±26.1%）,有明显统计学差异（p < 0.001）,说明吗啡诱发细胞内Zn2+的释放。这一作用被一氧化氮合酶（NOS）的抑制剂L-NAME所阻止（100.6±6.6%）,与空白对照组相比无统计学差异,说明NO参与吗啡引起Zn2+的释放过程。2吗啡使NO特异性荧光标记染料DAF-FM的荧光强度值明显增加（154.9±62.2%）,与空白对照（102.2±5.3%）相比有统计学差异（p< 0.05）,说明吗啡刺激NO生成。3鸟苷酸环化酶的抑制剂ODQ和NS2028明显减弱吗啡引起Zn2+释放的作用,Newport Green DCF的荧光强度值分别为119.3±6.3%和108.0±5.9%,与吗啡处理组的荧光强度（156.9±10.6%）相比,均有统计学差异（p= 0.002、p < 0.001）,说明环磷酸鸟苷（cGMP）参与吗啡诱导Zn2+释放的作用。蛋白激酶G（PKG）的特异性抑制剂KT5823也同样抑制吗啡的作用,Newport Green DCF荧光强度为106.5±3.2 %,与吗啡处理组相比有统计学差异（p < 0.001）,表明PKG也在吗啡诱导Zn2+释放的过程中起重要作用。4吗啡和Zn2+都能够明显增加GSK-3β（Ser9）的磷酸化,提示吗啡可能通过Zn2+而抑制GSK-3β的活性。5线粒体膜电位（?Ψm）测定实验中,100μM H2O2使TMRE的荧光强度明显减弱（45.1±8.2%）,提示氧化应激使mPTP开放,而吗啡可防止这种作用（90.0±2.0%）,与H2O2对照相比有明显统计学差异（p < 0.001）,说明吗啡抑制了mPTP的开放;PKG的抑制剂KT5823或Zn2+的螯合剂TPEN阻断吗啡的作用,TMRE的荧光强度分别为51.1±4.8%、57.5±2.0%,明显低于吗啡组的TMRE荧光值,说明吗啡可能是通过PKG/Zn2+通路阻止mPTP开放而产生心肌保护作用。6线粒体Ca2+测定实验中,与H2O2对照相比（218.4±21.9%）,吗啡使线粒体Ca2+特异性荧光标记染料Rhod-2荧光值减弱（128.0±10.6%）,有统计学差异（p= 0.007）,说明吗啡抑制了氧化应激引起的线粒体Ca2+超载,进一步证实了吗啡对mPTP开放的抑制性效应。7外源性Zn2+阻止氧化应激引起△Ψm减弱的作用在转染了持续激活型GSK-3β突变基因质粒的细胞中消失,提示吗啡可能通过Zn2+而抑制GSK-3β的活性,从而阻止mPTP开放。结论:吗啡通过NO/cGMP/PKG信号通路诱发心肌细胞内Zn2+的释放并使GSK-3β失活,失活了的GSK-3β最终阻止mPTP的开放并产生心肌保护作用。

全文目录


中文摘要  3-6
英文摘要  6-9
英文缩写  9-10
研究论文吗啡诱导的心肌保护作用信号机制研究  10-46
  前言  10-12
  材料与方法  12-24
  结果  24-33
  讨论  33-36
  结论  36-37
  实验附图  37-40
  参考文献  40-46
综述 心肌保护的信号转导机制  46-54
  参考文献  50-54
致谢  54-55
个人简历  55

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 心脏、血管（循环系）疾病 > 心脏疾病 > 心肌疾病 > 心肌梗塞
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