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补阳还五汤对血管性痴呆大鼠海马神经元谷氨酸受体表达的影响

作　者: 李君
导　师: 高维娟
学　校: 承德医学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 血管性痴呆 大鼠 海马 长时程增强 谷氨酸 N-甲基-D-天门冬氨酸受体 α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸受体 补阳还五汤
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的血管性痴呆(vascular dementia, VD)是危害人类健康的常见疾病之一。患者常伴有一定的功能障碍,其中学习记忆障碍是常见的并发症。海马是与脑的学习记忆功能关系密切的脑区,且在脑缺血时经常累及。脑缺血损伤后的病理生理过程复杂,主要与兴奋性氨基酸毒性、钙离子稳态失衡、星形胶质细胞反应、细胞凋亡几方面有关。谷氨酸(Glutamate, Glu)是中枢神经系统中一种最重要的兴奋性神经递质,主要分布于大脑皮质、海马、小脑和纹状体,在学习、记忆、突触可塑性及大脑发育等方面均起重要作用。研究证实,Glu的神经递质作用是通过兴奋性氨基酸受体而实现的,受体活性的变化、受体数目的增减都会对突触效能产生明显的影响。在对突触长时程增强(Long-term potentiation, LTP)的研究中,人们发现谷氨酸受体对LTP的诱导和维持具有重要意义,这些受体的特异性拮抗剂不但可阻断LTP的诱导,而且可破坏多种学习和记忆行为。现代大量资料证实学习记忆机制是突触传递效能的长时程增强(LTP),它被认为是学习与记忆的一个细胞模型。既往实验表明,药物干预能影响氨基酸受体在脑缺血损伤细胞中的表达;益气活血化瘀类中药已被证实可改善脑梗死后引起的学习记忆功能障碍。补阳还五汤是益气活血中药的代表方剂,既往研究发现它具有降低血黏度、抗血栓形成、提高脑血管内皮一氧化氮(NO)和前列环素(PGI2)的水平、抑制谷氨酸释放、降低细胞内钙浓度和花生四烯酸含量、抑制自由基和提高抗氧化酶活性等作用,可改善局部脑血流量和细胞能量代谢、神经功能缺失及脑缺血记忆障碍。但有关该药对VD的治疗作用及其机制研究报道较少。基于此,本实验通过VD大鼠海马神经元谷氨酸受体的变化,观察补阳还五汤治疗VD的效果并探讨其作用机制。方法1.动物模型的建立采用四血管阻断( four vessel occlusion, 4VO)法,造成脑组织反复缺血/再灌注,建立了大鼠VD模型,同时建立假手术组排除手术本身对大鼠所致的影响。2.造模后大鼠行为学评估成年雄性SD大鼠144只,体质量200 g±20 g,按数字表法随机分为假手术组、VD模型组、补阳还五汤治疗组(50g/kg/d)和尼莫地平组(20mg/kg/d),每组36只。除假手术组外,其余各组均采用四血管阻断法建立VD大鼠模型。术后各组大鼠均灌胃给药,共30 d。大鼠分别在术前、术后第25d～30d,用Morris水迷宫观测大鼠的平均逃避潜伏期(sec)和跨越平台次数(number/60 sec),评价各组大鼠空间学习记忆能力的变化。3.标本采集与处理术后第30d,每组大鼠中随机选取12只,0.1%戊巴比妥钠(10mg/mL) 45mg/kg腹腔麻醉,4%多聚甲醛灌注固定,取视交叉后4mm与小脑前之间的部分即海马脑组织,石蜡包埋,冠状切片,制成5μm厚连续切片;其余各组大鼠,0.1%戊巴比妥钠腹腔麻醉,迅速断头处死,在低温修块台上分离出双侧海马组织,置于Eppendorf管中,-80℃保存。4.大鼠海马CA1神经元病理形态学观察HE染色,光镜下观察海马CA1区神经元形态改变。5.谷氨酸受体免疫组化染色按照说明书的操作顺序进行SP法免疫组化染色,镜下观察各组海马CA1区NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1的阳性神经元数目(面密度Sv值对二者的变化进行定量)。6. Western-Blot检测海马组织谷氨酸受体蛋白的表达水平称取海马组织,提取总蛋白,BCA法进行蛋白浓度定量。应用Western-Blot方法检测各组大鼠海马组织NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1的蛋白表达水平。7.实时荧光定量PCR检测海马组织谷氨酸受体mRNA的表达水平冰上迅速分离大鼠海马,Trizol提取海马总RNA,逆转录cDNA,采用PrimerScriptTM实时荧光定量PCR试剂盒一步法检测各组海马组织中NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1 mRNA的表达水平。结果1.水迷宫试验(1)术前各组大鼠平均逃避潜伏期和跨越平台次数组间差异无显著性(P>0.05);(2)术后第25d～30d,与假手术组比较,VD模型组平均逃避潜伏期明显延长和跨越平台次数显著减少(P<0.05) ;假手术组、补阳还五汤治疗组、尼莫地平组之间的学习和记忆成绩无显著性差异(P>0.05)。以上结果提示VD模型大鼠的学习和记忆成绩降低,补阳还五汤可以提高其学习和记忆成绩。2.光镜下观察大鼠海马CA1区神经元病理学特征(1)假手术组大鼠海马CA1区锥体细胞核大而圆,核仁明显,细胞排列致密整齐;(2)相比之下,VD模型组大鼠海马CA1区锥体细胞松散,层次不清,有细胞缺失现象,炎性细胞浸润,部分细胞旁有空染区,核固缩、胞质浓染、胞体变小,并且有胶质细胞增生形成结节;(3)补阳还五汤治疗组和尼莫地平组大鼠海马CA1区锥体细胞排列尚整齐,未发现炎性细胞浸润,核固缩现象较少见。3.谷氨酸受体免疫组化染色(1)与假手术组海马CA1区NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1阳性神经元面密度值比较,VD模型组明显减少(P<0.05);(2)与VD模型组比较,补阳还五汤治疗组和尼莫地平组大鼠海马CA1区NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1阳性神经元面密度值明显增多(P<0.05);(3)补阳还五汤治疗组、尼莫地平组、假手术组海马CA1区NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1阳性神经元面密度值之间无明显差异(P>0.05)。此结果提示VD大鼠海马CA1区NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1水平降低参与了VD的发病机制,补阳还五汤可以促进VD大鼠海马CA1区NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1的表达水平而提高其学习和记忆成绩。4. Western-Blot检测海马组织谷氨酸受体蛋白的表达水平(1)与假手术组大鼠海马组织NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1蛋白表达水平比较,VD模型组受体蛋白表达水平显著降低(P<0.05);(2)与VD模型组比较,补阳还五汤治疗组和尼莫地平组大鼠海马组织NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1蛋白表达水平显著升高(P<0.05);(3)假手术组、补阳还五汤治疗组、尼莫地平组大鼠海马组织NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1蛋白表达水平之间无明显差异(P>0.05)。此可以提示VD大鼠海马组织NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1蛋白表达水平的降低参与了VD的发病机制,补阳还五汤可以促进VD大鼠海马神经元NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1蛋白的表达水平而提高其学习和记忆成绩。5.实时荧光定量PCR检测海马组织谷氨酸受体mRNA的表达水平(1)与假手术组NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1目的基因表达量比较,VD模型组受体目的基因表达量明显降低(P<0.05);(2)与VD模型组比较,补阳还五汤治疗组和尼莫地平组NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1目的基因表达量明显升高(P<0.05);(3)补阳还五汤治疗组、尼莫地平组及假手术组NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1目的基因表达量之间比较差异无显著性(P>0.05);(4)各组单位看家基因(β-actin)中NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1的表达量也存在相同差异。此可以提示VD大鼠海马组织NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1 mRNA表达水平的降低参与了VD的发病机制,补阳还五汤可以促进VD大鼠海马神经元NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1 mRNA的表达水平而提高其学习和记忆成绩。结论1.本实验建立的VD大鼠模型可模拟人类VD以学习和记忆能力缺损为主的认知功能障碍,是研究VD比较理想的动物模型,对深入研究VD是可行的。VD模型大鼠海马CA1区出现病理性变化。2. VD大鼠海马NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B蛋白及mRNA表达水平降低,与其学习和记忆成绩下降相一致。提示NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B表达水平降低可能参与了VD的发病。3. VD大鼠海马AMPA-GluR1蛋白及mRNA表达水平降低,与其学习和记忆成绩下降相一致。提示AMPA-GluR1表达水平降低可能参与了VD的发病。4.补阳还五汤通过上调VD大鼠海马组织NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1蛋白及其mRNA表达水平,改善海马组织CA1病理变化,减轻脑缺血再灌注对海马神经元的损伤,从而发挥对VD的治疗作用,提高VD大鼠的学习和记忆能力。提示该药可能具有改善VD的药理学作用。

全文目录


中文摘要  6-11
英文摘要  11-17
英文缩写  17-18
研究论文 补阳还五汤对血管性痴呆大鼠海马神经元谷氨酸受体表达的影响  18-21
  引言  18-21
第一部分 血管性痴呆大鼠模型的建立、海马病理学的变化及补阳还五汤的治疗作用  21-37
  前言  21
  材料与方法  21-26
  结果  26-28
  附图  28-32
  附表  32-33
  讨论  33-34
  小结  34-35
  参考文献  35-37
第二部分 补阳还五汤对血管性痴呆大鼠海马神经元NMDA 受体蛋白及其mRNA 表达的影响  37-73
  前言  37
  材料与方法  37-49
  结果  49-53
  附图  53-63
  附表  63-65
  讨论  65-68
  小结  68-69
  参考文献  69-73
第三部分 补阳还五汤对血管性痴呆大鼠海马神经元AMPA-GluR1蛋白及其mRNA 表达的影响  73-90
  前言  73
  材料与方法  73-76
  结果  76-78
  附图  78-83
  附表  83-84
  讨论  84-86
  小结  86-87
  参考文献  87-90
结论  90-91
综述一  91-100
  参考文献  97-100
综述二  100-109
  参考文献  106-109
综述三  109-120
  参考文献  116-120
致谢  120-121
个人简历  121

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学 > 中药实验药理
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