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白眉蝮蛇蛇毒L-氨基酸氧化酶的表征

作　者: 郭春梅
导　师: 孙明忠
学　校: 大连医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: L-氨基酸氧化酶 白眉蝮蛇蛇毒 表征
分类号: Q55
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


蛇毒（SV）是由多种生物活性多肽、蛋白质、核苷、胺和金属离子等组成的复杂混合物。L-氨基酸氧化酶（LAAOs）作为蛇毒中的一个重要成分,有着多样的生物学活性,其通过催化氧化L-氨基酸产生过氧化氢（H2O2）赋予蛇毒一定的毒性。目前,从蛇毒中分离得到的LAAOs以数十计,大量研究结果表明,蛇毒L-氨基酸氧化酶（SV-LAAOs）可以诱导或抑制血小板聚集、刺激水肿形成、诱导出血或溶血,具有抗凝活性、细胞毒性、抗病毒、抗肿瘤、抗血栓、抗菌消炎、抗利什曼原虫、诱导细胞凋亡和抗HIV活性等多种生理作用。SV-LAAOs是一个新的毒性蛇毒蛋白群,是非常有趣的一类活性物质,具有潜在的药物开发价值和临床应用前景。采用离子交换、凝胶过滤层析及高效液相色谱层析从长白山白眉蝮蛇（Agkistrodon blomhoffii Ussurensis）蛇毒中纯化了一种L-氨基酸氧化酶,命名为Akbu-LAAO。Akbu-LAAO在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上显示单一泳带,结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF mass spectrometry）表征结果:Akbu-LAAO是由两个相同亚基组成的分子量约为124.4 kDa的二聚体。Akbu-LAAO经胰蛋白酶胶内酶解,产生的肽段经高效液相色谱-电喷雾串联质谱（HPLC- nESI-MS/MS）进行序列分析,蛋白鉴定采用TurboSequest Bioworks软件完成,质谱鉴定得到了10个肽段序列:VVEELKR、YPVKPSEEGK、KFWEDEGIHGGK、VTVVYQTPAK、HDDIFAYEK、IKFEPPLPPK、SAGQLYEESLGK、FDEIVGGMDK、RFDEIVDGMDK、FDEIV DGMDKLPTAM#YR。Akbu-LAAO与来源于蛇毒Calloselasma rhodost, Agkistrodon halys, Daboia russellii siamensis和Trimeresurus stejnegeri的LAAOs的氨基酸序列有同源性,但比对分析表明Akbu-LAAO是一种新的蛇毒LAAO。采用辣根过氧化物酶偶联法,以L-亮氨酸（L-Leu）为酶的反应底物,发现Akbu-LAAO水解活性的最适pH为4.7;在溶液pH为4.7时,Akbu-LAAO催化L-Leu反应的Km值为2.1 mM。电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）检测结果表明每个Akbu-LAAO分子中含有4个Zn2+,Zn2+的存在并不影响Akbu-LAAO的水解活性,但是Zn2+的去除却使Akbu-LAAO的最大荧光发射峰的强度降低61%,这说明Zn2+对Akbu-LAAO的水解活性不是必需的,但有助于维持酶结构完整性。外源金属离子Mg2、Mn2+、Ca2+、Ce3+、Nd3+、Co2+和Tb3+可以增加Akbu-LAAO对L-Leu的水解活性,另外,Ni2+、La3+和Gd3+轻微地降低了Akbu-LAAO水解L-Leu的活性,Fe2+、Cu2+和Eu2+/Eu3+对其水解活性影响不大。我们发现Akbu-LAAO对人和兔血小板的聚集有一定抑制及解聚作用,但抑制作用有显著差别,以动物血小板代替人血小板进行类似实验有一定风险,结果表明Akbu-LAAO在治疗心血管疾病方面将起到一定的作用。Akbu-LAAO能够显著抑制金黄色葡萄球菌生长,是相同条件下头孢类药物剂效的18倍,可作为潜在的抑菌剂使用。总之,本论文采用四步层析纯化方法从长白山白眉蝮蛇蛇毒中分离得到了一种新的天然的LAAO,具有一定潜在的药物开发价值和临床应用前景。对Akbu-LAAO的生物化学、酶学性质、结构和生物活性的表征,为Akbu-LAAO的进一步开发和应用奠定了一定基础。

全文目录


摘要  6-8Abstract  8-10前言  10-11材料和方法  11-16  一、实验材料  11-12  二、实验方法  12-16结果  16-24  一、纯化  16-18  二、纯度和分子量  18  三、序列鉴定  18-19  四、酶学性质  19-21  五、金属离子作用  21-23  六、血小板作用  23  七、抗菌活性  23-24讨论  24-29结论  29-30参考文献  30-34综述  34-51  参考文献  46-51发表论文  51-52缩写词  52-53致谢  53

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 酶
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