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冰草组织培养再生体系建立及耐旱转基因研究

作　者: 霍秀文
导　师: 云锦凤；米福贵；魏建华
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 草业科学
关键词: 冰草植株再生遗传转化 P5CS基因 CBF4 CBF4启动子
分类号: S54
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

冰草属（Agropyron Gaertn.）植物是寿命较长的多年生疏丛型禾本科牧草，广泛分布于干旱、半干旱草原和荒漠草原，抗逆性较强，春季返青早，秋季枯黄晚，茎叶柔嫩，营养丰富，适口性好，在我国北方地区有广泛的种植面积，是干旱半干旱地区改良草场以及建立人工草地和生态建设的重要草种。本研究以冰草属植物中的4个品种——蒙古冰草新品系（A.mongolicum Keng）、航道冰草（A.cristatum cv. ‘Fairway’）、诺丹冰草（A.desertorum cv.‘Nordan’）和一个种间杂种冰草——蒙农杂种冰草（A.cristatumхA.desertorum cv.‘Hycrest-Mengnong’）为材料，分别以幼穗为外植体建立了冰草组织培养再生体系。在此基础上，以调控脯氨酸生物合成最后一步的关键酶的突变体基因P5CS为目标基因，bar基因为筛选标记基因，用基因枪法轰击幼穗诱导的愈伤组织，获得转基因植株，为冰草的遗传改良提供新种质。植物转录因子在植物的生长发育及其对外界环境的反应中起着重要的作用。CBF4转录激活因子是一类受干旱特异诱导的反式作用因子。它能与CRT/DREDNA调控元件特异结合，促进启动子中含有这一调控元件的脱水诱导基因的表达，从而激活植物体内的多种耐逆机制。但是有关CBF4启动子的特异性研究，尚未见相关报道。为研究CBF4基因及其启动子在转基因冰草中的表达特性，探索其在冰草抗逆基因工程研究中的应用价值，利用PCR方法从拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组DNA中分离得到了CBF4及其启动子，并对CBF4启动子进行了序列分析和初步的功能分析。研究初步获得以下结果：1.以冰草幼穗为外植体诱导愈伤组织的最适培养基为改良MS+2,4-D 2.0mg/L，诱导率83.5%；2.2002年分化培养基为MS(无附加成分)，分化率59.6％。2003年优化分化培养基为MS+KT0.2mg/L，分化率74.5％；3.生根培养基为1/2MS，生根率100％；4.适宜的取样时期为孕穗期，长度介于1.0～3.0cm的幼穗为最适宜的外植体；5.4种冰草材料均可以幼穗为外植体诱导愈伤组织并分化形成完整植株；6.以幼穗诱导的愈伤组织为受体，采用基因枪轰击法转化冰草获得转基因植株；7.PCR和Southern检测表明外源基因P5CS已整合到冰草属植物基因组DNA中；8.RT-PCR检测表明目的基因已在冰草转基因植株的转录水平表达；9.2002年和2003年P5CS基因的遗传转化率分别为0.09%和0.11%；10.采用PCR方法从拟南芥中分离了CBF4基因及其启动子序列。 <WP=3>11.采用生物信息学方法对启动子进行序列分析，表明CBF4启动子可能为逆境诱导型启动子。将其与GUS基因融合转化烟草，GUS活性检测初步表明该启动子受干旱逆境诱导。

全文目录

1 引言  10-25
  1.1 牧草组织培养研究进展  10-13
    1.1.1 植株再生体系的建立  10-11
    1.1.2 牧草组织培养技术的应用  11-13
  1.2 牧草基因工程研究进展  13-21
    1.2.1 建立遗传转化体系  13-15
    1.2.2 选择标记基因与启动子  15-16
    1.2.3 基因工程的遗传改良  16-21
  1.3 牧草转基因技术存在的问题  21-22
    1.3.1 高效组织培养再生体系的建立  21
    1.3.2 外源基因的高效表达  21-22
    1.3.3 转基因牧草向大田释放的风险性  22
  1.4 展望  22-23
  1.5 本研究的目的及意义  23-25
2 以幼穗为外植体的冰草属植物组织培养再生体系的建立  25-37
  2.1 材料与方法  25-27
    2.1.1 冰草材料  25
    2.1.2 外植体  25
    2.1.3 愈伤组织的诱导  25-26
    2.1.4 诱导分化和植株再生  26-27
    2.1.5 植株再生  27
    2.1.6 植株移栽  27
    2.1.7 评价指标  27
  2.2 结果与分析  27-33
    2.2.1 愈伤组织的诱导  27-28
    2.2.2 愈伤组织的分化  28-29
    2.2.3 幼穗大小对诱导愈伤组织和植株再生的影响  29-32
    2.2.4 4种冰草材料愈伤组织诱导和分化情况  32-33
  2.3 结论  33
  2.4 讨论  33-37
    2.4.1 培养基成分对再生植株的影响  34
    2.4.2 外源激素的作用  34-35
    2.4.3 幼穗取材时期  35
    2.4.4 基因型差异  35-36
    2.4.5 低温预处理的作用  36-37
3 冰草遗传转化体系的建立及转抗旱基因的研究  37-60
  3.1 材料与方法  37-49
    3.1.1 冰草属植物  37
    3.1.2 靶材料准备  37
    3.1.3 目的基因与重组质粒  37
    3.1.4 试剂  37
    3.1.5 仪器  37
    3.1.6 构建共转化表达载体pHBP5CS  37-38
    3.1.7 构建植物表达载体pBPI-P5CS  38-41
    3.1.8 构建双元表达载体pSHKP5CS  41
    3.1.9 重组质粒DNA的提取和纯化  41-42
    3.1.10 基因枪共转化  42-43
    3.1.11 转基因植株的除草剂筛选  43-44
    3.1.12 转基因植株的分子检测  44-49
      3.1.12.1 PCR扩增分析  44-45
      3.1.12.2 Southern检测  45-48
      3.1.12.3 RT-PCR扩增分析  48-49
  3.2 结果与分析  49-55
    3.2.1 表达载体的构建  49-51
      3.2.1.1 共转化植物表达载体pHBP5CS的构建  50
      3.2.1.2 植物表达载体pBPI-P5CS的构建  50-51
      3.2.1.3 双元表达载体pSHK-P5CS的构建  51
    3.2.2 转基因植株的抗除草剂筛选  51-53
    3.2.3 转基因植株的分子检测  53-54
      3.2.3.1 转基因植株的PCR检测  53
      3.2.3.2 转基因植株的Southern检测  53
      3.2.3.3 转基因植株的RT-PCR检测  53-54
    3.2.4 转基因植株的遗传转化率  54-55
  3.3 结论  55
  3.4 讨论  55-60
    3.4.1 冰草的遗传转化方法  55-56
    3.4.2 影响基因转化频率的因素  56-57
    3.4.3 共转化  57-58
    3.4.4 无载体主干序列的基因表达框的遗传转化  58-59
    3.4.5 外源基因在转基因植株后代中的遗传行为  59-60
4 拟南芥CBF4基因及其启动子序列的分离与启动子功能鉴定  60-75
  4.1 材料与方法  62-67
    4.1.1 拟南芥材料  62-63
    4.1.2 提取基因组DNA  63
    4.1.3 引物设计  63
    4.1.4 PCR  63
    4.1.5 扩增产物的克隆及序列分析  63-64
    4.1.6 表达载体构建  64
    4.1.7 表达载体质粒转化农杆菌  64-66
    4.1.8 农杆菌介导的烟草转化  66-67
    4.1.9 组织化学法检测报告基因GUS的表达  67
  4.2 结果与分析  67-73
    4.2.1 序列分析  67-72
      4.2.1.1 拟南芥CBF4 基因序列及同源性分析  68-69
      4.2.1.2 拟南芥CBF4启动子DNA序列及同源性分析  69-71
      4.2.1.3 启动子功能预测分析  71-72
    4.2.2 双元表达载体构建  72-73
    4.2.3 转基因烟草的PCR检测  73
    4.2.4 GUS活性的组织染色分析  73
  4.3 结论  73-74
  4.4 讨论  74-75
5 结论  75-76
致谢  76-77
参考文献  77-85
附图  85-92
附图说明  92-93
作者简介  93

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