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口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因在原核和真核细胞中的表达

作　者: 吴雨霞
导　师: 罗玉柱；刘在新
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 口蹄疫病毒结构蛋白 VP1基因表达
分类号: S852.65
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
下　载: 374次
引　用: 2次
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内容摘要

口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）引起的偶蹄动物传染病，严重危害家畜的生产力和畜产品质量，给畜牧业和进出口贸易造成较大的经济损失，直接威胁着国际贸易和国家声誉及人类食品卫生，因而受到人们的普遍关注。口蹄疫病毒衣壳由4种结构蛋白VP1-4各60个拷贝组成，VP1蛋白又称1D蛋白，其基因位于基因组的2977-3615，编码213个氨基酸。早期研究表明，结构蛋白VP1暴露在病毒颗粒的表面，是诱导产生中和抗体的主要成分。本试验以保存的pGEM-VP1质粒为模板，用特异性表达引物PCR扩增得到口蹄疫病毒（FMDV）VP1目的基因（639bp），对目的基因和穿梭表达载体pTriEx分别以相同的限制性酶NcolⅠ和XholⅠ消化后，经连接酶连接构建成重组表达载体，转化宿主菌BL21（DE₃）pLySs后得到重组质粒pTriEx—VP1，通过酶切及PCR扩增鉴定筛选出阳性克隆，测序证明目的基因正确插入到表达载体。随后用IPTG诱导VP1基因的表达，收集不同时间的菌液进行SDS—PAGE电泳、Western-blotting分析检测，结果表明结构蛋白VP1基因在大肠杆菌中能高效表达，表达量占菌体蛋白总量的26％以上，表达的目的蛋白的分子量约为26kD。该表达产物为融合蛋白，能被口蹄疫阳性血清所识别。进一步的试验证明表达产物为可溶性的蛋白，此蛋白不需要进行变性、复性的纯化处理，用ProBond^TM Column进行亲和层析得到初步纯化的VP1蛋白，经ELISA检测此蛋白有活性。将穿梭重组质粒pTriEx—VP1转染BHK21细胞，通过双抗体夹心ELISA方法和间接免疫荧光标记方法，检测细胞中表达的口蹄疫病毒抗原。结果表明，重组质粒pTriEx—VP1能在BHK21细胞中表达，但表达量较低。本试验为进一步研究VP1的晶体结构、建立口蹄疫的诊断方法提供了材料。

全文目录

致谢  2-5
中文摘要  5-6
英文摘要  6-7
1 前言  7-9
2 材料  9
  2.1 质粒、菌种、细胞和质粒载体  9
  2.2 酶和生物试剂  9
  2.3 主要仪器  9
3 方法  9-20
  3.1 引物设计与合成  9-10
  3.2 感受态细胞的制备  10-11
  3.3 质粒的转化  11
  3.4 质粒的提取与目的基因的扩增  11-13
    3.4.1 碱裂解法小量提取质粒  11-12
    3.4.2 目的基因的扩增  12
    3.4.3 PCR产物的回收  12-13
  3.5 目的片段与载体的酶切回收  13
  3.6 目的片段与表达载体的连接与转化  13-14
  3.7 穿梭表达质粒的提取  14-15
  3.8 穿梭表达质粒的鉴定  15
  3.9 目的基因的核苷酸序列测定  15
  3.10 穿梭表达质粒在大肠杆菌中诱导表达及检测  15-18
    3.10.1 穿梭表达质粒在大肠杆菌中诱导表达  15-16
    3.10.2 SDS-PAGE电泳  16
    3.10.3 Western blotting分析  16-17
    3.10.4 重组蛋白的纯化及检测  17-18
      3.10.4.1 重组蛋白的纯化  17
      3.10.4.2 间接ELISA检测  17-18
  3.11 穿梭表达重组质粒在真核细胞中的表达及检测  18-20
    3.11.1 转染质粒的制备  18
    3.11.2 BHK-21细胞的转染  18-19
    3.11.3 转染细胞的筛选  19
    3.11.4 转染细胞中表达蛋白质的检测  19-20
      3.11.4.1 间接免疫荧光检测  19
      3.11.4.2 RT-PCR检测  19
      3.11.4.3 双抗体夹心ELISA检测  19-20
4 结果  20-29
  4.1 表达载体的构建  20
    4.1.1 目的基因的获得  20
    4.1.2 重组表达载体的构建  20
  4.2 重组质粒的鉴定  20-24
    4.2.1 电泳鉴定  20-21
    4.2.2 PCR  21
    4.2.3 酶切鉴定  21
    4.2.4 重组质粒的序列分析  21-24
  4.3 原核表达产物的检测  24-25
    4.3.1 表达产物的SDS-PAGE电泳  24-25
    4.3.2 Western-blotting分析  25
  4.4 原核表达产物的纯化及检测  25-27
    4.4.1 稳定性试验  25-26
    4.4.2 溶解性判定试验  26
    4.4.3 纯化结果  26-27
  4.5 真核表达产物的检测  27-29
    4.5.1 间接免疫荧光检测结果  27-28
    4.5.2 夹心ELISA检测结果  28-29
5 讨论  29-33
  5.1 表达载体的构建  29
  5.2 pTriEx-VP1在大肠杆菌中的表达及纯化  29
  5.3 细胞转染及筛选  29-30
  5.4 影响pTriEx-VP1在BHK21细胞中高效表达的因素  30-32
  5.5 关于利用细菌制备口蹄疫病毒基因疫苗的问题  32-33
结论  33-34
参考文献  34-36
文献综述  36-50
参考文献  50-51

口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因在原核和真核细胞中的表达

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