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口蹄疫病毒结构蛋白VP4基因的真核表达

作　者: 王若
导　师: 王家鑫
学　校: 河北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 口蹄疫病毒 VP4基因真核表达细胞转染 HeLa细胞
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(FMD virus, FMDV)感染偶蹄动物所引起的一种急性、热性和传播极为迅速的接触性传染病。严重危害家畜的生产力和畜产品质量,不仅给畜牧业生产和进出口贸易造成了很大的经济损失,而且直接威胁人类的食品安全、国际贸易和国家形象,因而被世界动物卫生组织(OIE)列为A类动物传染病,并受到世界各地人们的普遍关注。目前,针对预防口蹄疫疾病的爆发和流行,多数发展中国家主要采用注射灭活口蹄疫病毒疫苗的方法。但灭活疫苗存在灭活不彻底和保护期短等缺点。因此,新型口蹄疫疫苗及免疫策略的研究已成为亟待解决的焦点问题。口蹄疫病毒衣壳由4种结构蛋白VP1, VP2, VP3, VP4各60个拷贝组成,一种抗Asia I型口蹄疫病毒的多肽疫苗,其特征在于由AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1和VP4上B细胞表位、T细胞表位氨基酸的DNA序列串联单独编码表位蛋白,或与载体大分子相连编码表位融合蛋白而获得,其中B细胞表位采用AsiaⅠ型口蹄疫病毒结构蛋白VP1 80～101、133～160和200～213位氨基酸,T细胞表位包括AsiaⅠ型VP4 20～34位氨基酸或VP1 20～34和35～48位氨基酸。本实验以质粒pUC57-VP4为模板,经过EcoRI和BamHI双酶切鉴定和基因序列测定得到FMDV的VP4基因,对目的基因和真核表达载体pcDNA3.1(+)分别以相同的限制性酶EcoRI和BamHI消化后,经T4连接酶连接构建重组质粒,转化宿主菌大肠杆菌DH5α后得到重组质粒pcDNA3.1-VP4,经酶切鉴定正确后,对重组质粒pcDNA3.1-VP4进行测序。结果表明,VP4基因定向克隆到表达载体pcDNA3.1中。将VP4基因与GenBank发表的序列进行同源性比较,证明本研究所用毒株与Foot-and-mouth disease virus O isolate O/NYOO基因编码序列(NCBI登录号分别为AY333431.1)同源性最高,可达100%。结果证明pcDNA3.1-VP4重组质粒构建成功。为鉴定pcDNA3.1-VP4基因能否在真核细胞中表达,本研究用重组质粒pcDNA3.1-VP4转染HeLa细胞,同时用空载体转染HeLa细胞作为阴性对照。SDS-PAGE检测结果显示,在分子量约为8 kD处有一条明显的蛋白条带,而空载体在相应位置未见蛋白条带。结果证明质粒构建成功并可在体外表达VP4蛋白,这为进一步用VP4作为结构蛋白疫苗抗原研究、以及探索可能的疫苗抗原修饰和佐剂筛选奠定了坚实的基础。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
1 引言  10-21
  1.1 口蹄疫的研究进展  10-15
    1.1.1 口蹄疫病毒的结构  11
    1.1.2 FMDV 的抗原性  11-12
    1.1.3 FMDV 的VP4 基因  12-13
    1.1.4 流行病学  13-14
    1.1.5 致病性  14
    1.1.6 FMDV 感染的发病机制  14-15
  1.2 树突状细胞的研究进展  15-19
    1.2.1 DC 的起源和分类  15-16
    1.2.2 DC 的生物学特性  16
    1.2.3 DC 与口蹄疫病毒的相互关系  16-17
    1.2.4 DC 对抗原提呈作用及途径  17-19
  1.3 本研究的目的和意义  19-21
2 实验材料及仪器  21-23
  2.1 菌株、载体和细胞  21
  2.2 实验材料  21-22
  2.3 主要仪器设备  22-23
3. 实验方法  23-35
  3.1 主要试剂配置  23-25
  3.2 PCDNA3.1-VP4 重组质粒的构建  25-30
    3.2.1 重组质粒pUC57-VP4 的小量制备  25-27
    3.2.2 真核表达载体pcDNA3.1(+)的制备  27-28
    3.2.3 VP4 与pcDNA3.1(+)定向连接  28-29
    3.2.4 连接产物转化宿主菌  29
    3.2.5 重组质粒pcDNA3.1-VP4 真核表达载体的鉴定  29-30
    3.2.6 重组质粒pcDNA3.1-VP4 的DNA 序列测定与分析  30
  3.3 重组质粒PCDNA3.1-VP4 转染 HELA 细胞  30-35
    3.3.1 细胞培养  30-31
    3.3.2 G418 筛选浓度的确定  31
    3.3.3 转染质粒的pcDNA3.1-VP4 制备  31
    3.3.4 pcDNA3.1-VP4 转染HeLa 细胞和转基因细胞株的筛选  31-33
    3.3.5 FMDV-VP4 在HeLa 细胞中的表达  33-35
4 结果  35-38
  4.1 PCDNA3.1-VP4 重组质粒的构建  35
  4.2 重组质粒PUC57-VP4 的酶切鉴定  35-36
  4.3 重组质粒测序鉴定结果  36-37
  4.4 SDS-PAGE 检测FMDV- VP4 在HELA 细胞的表达  37-38
5 讨论  38-41
  5.1 FMDV 真核表达载体的构建  38-39
  5.2 细胞转染及筛选  39-41
6 结论  41-43
  6.1 成功构建了口蹄疫病毒VP4 基因的重组质粒PCDNA 3.1-VP4  41
  6.2 成功筛选出并稳定转染了VP4 基因的HELA 细胞表达系统  41
  6.3 成功检测到HELA 细胞中表达的VP4 蛋白，分子质量约为8 KD，提示VP4 基因在HELA细胞中形成了稳定表达  41-43
参考文献  43-49
附图及说明  49-50
在读期间发表的学术论文  50-51
作者简历  51-52
致谢  52-53

口蹄疫病毒结构蛋白VP4基因的真核表达

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